長(zhǎng)垣市副豬嗜血桿菌病分離鑒定、血清分型與耐藥性檢測(cè)

嚴(yán)洪濤

（長(zhǎng)垣市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南 長(zhǎng)垣 453400）

副豬嗜血桿菌（Hps）是引起豬格拉瑟氏病的重要病原。Hps作為豬上呼吸道的早期常見(jiàn)定殖菌，也是影響豬群健康的條件致病菌。在豬免疫力下降、免疫抑制或者外界應(yīng)激作用下，通常引起病豬全身感染和多發(fā)性漿膜炎、肺炎、腦膜炎和關(guān)節(jié)炎，出現(xiàn)發(fā)熱、呼吸困難、咳嗽、關(guān)節(jié)腫脹和部分神經(jīng)癥狀。此外，Hps感染豬容易繼發(fā)或混合感染豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬鏈球菌等其他致病微生物，臨床上共染病例多發(fā)。各品種和生長(zhǎng)階段的豬均對(duì)Hps具有易感性，2～8周齡的仔豬易感性最強(qiáng)，發(fā)病率一般為10%～15%，死亡率可達(dá)50%以上［1］，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。Hps 血清型較多，有關(guān)專(zhuān)家用兔抗血清作免疫擴(kuò)散試驗(yàn)對(duì)不同Hps 菌株的熱穩(wěn)定抗原制劑進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)存在15個(gè)不同的血清型，此外，一些血清型還沒(méi)有分型。不同血清型菌株之間缺乏交叉保護(hù)，存在地區(qū)差異，甚至同一地區(qū)或豬場(chǎng)其血清型也不盡相同［2］。目前，控制這種疾病的主要方法是接種滅活疫苗，這有許多局限性。例如滅活疫苗并不包含在一個(gè)地區(qū)傳播的所有毒力血清型病毒。長(zhǎng)期以來(lái)抗生素在防治Hps 中得到廣泛應(yīng)用，起到了積極效果，但是不合理地使用使得Hps 耐藥性增強(qiáng)，耐藥譜進(jìn)一步擴(kuò)大，增加了防治難度。

該試驗(yàn)對(duì)從河南長(zhǎng)垣市部分養(yǎng)豬場(chǎng)采集疑似感染Hps病死豬的肺臟、脾臟、關(guān)節(jié)滲出液等組織病料進(jìn)行Hps常規(guī)分離、血清型分型鑒定及PCR檢測(cè)，并對(duì)分離菌株藥敏特性試驗(yàn)，為副豬嗜血桿菌流行情況和臨床篩選藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

無(wú)菌采集長(zhǎng)垣市部分豬場(chǎng)疑似Hps病死豬的肺臟、脾臟、淋巴結(jié)滲出液等組織病料，共35份。

1.2 主要試劑

胰蛋白大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基，胰蛋白大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基，犢牛血清，煙酰胺嘌呤二核苷酸（NAD），微量生化鑒定試劑管，抗生素藥敏紙片，HPs 1～15型標(biāo)準(zhǔn)血清試劑盒。

1.3 主要儀器

無(wú)菌操作臺(tái)，高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，水浴恒溫（搖床）振蕩器，CO2培養(yǎng)箱，高壓蒸氣滅菌鍋，PCR擴(kuò)增儀。

1.4 細(xì)菌純化培養(yǎng)及鏡檢

用無(wú)菌接種環(huán)挑取少許病料接種于TSA平板培養(yǎng)基，置于5%CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)48 h 后，再挑取疑似Hps典型菌落接種TSA平板，繼續(xù)進(jìn)行37 ℃、24 h純培養(yǎng)。挑取菌落制作涂片，革蘭氏染色，顯微鏡下觀(guān)察其形態(tài)學(xué)特征。

1.5 細(xì)菌NAD依賴(lài)性試驗(yàn)

挑取單菌落分別接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯、普通瓊脂、血瓊脂平板（含0.1%NAD）、TSA 平板（不含小牛血清和NAD）和TSB 培養(yǎng)基（含小牛血清和NAD），置于5% CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀(guān)察細(xì)菌不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況與菌落特征。

1.6 生化鑒定

挑取純化培養(yǎng)的單個(gè)菌落分別接種含有5%的無(wú)菌胎牛血清1 μl 和20% NAD 1 μl 的微量生化鑒定管，置于5%CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)24 h。過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)：在載玻片上將1滴3%的H2O2溶液和挑取少許的純培養(yǎng)菌落充分混合均勻，觀(guān)察是否產(chǎn)生氣泡。氧化酶試驗(yàn)：將氧化酶試劑直接滴在備檢菌落上，觀(guān)察結(jié)果。

1.7 血清型分型鑒定

參考徐引弟等［3］報(bào)道的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法進(jìn)行血清分型。取純化培養(yǎng)菌落，以PSB緩沖液稀釋?zhuān)? 000 r/min，離心3 min，棄去上清液，再加入PSB 緩沖液，高壓滅菌，8 000 r/min，離心3 min，即得分離菌株的分型抗原，用于瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)Hps血清分型鑒定。

1.8 PCR鑒定

采用水煮法提取分離菌基因組DNA，挑取單個(gè)菌落加入裝有100 μl 雙蒸水的離心管內(nèi)，混勻，沸水浴10 min后，-20 ℃冰浴10 min，于4 ℃、10 000 r/min離心3 min，取上清液作為DNA 模板備用。根據(jù)Hps 16S rRNA 序列設(shè)計(jì)引物，預(yù)期擴(kuò)增目的基因片段大小822 bp。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μl：2×Master Mix 10 μl，DNA模板2 μl，上、下游引物各1 μl，補(bǔ)足DEPH 水至20 μl。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性45 s，61 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，共30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取10 μl目的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.9 藥敏試驗(yàn)

應(yīng)用美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）推薦的K-B 瓊脂紙片法，檢測(cè)分離菌株對(duì)11 種抗生素的敏感性，按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果判定，抑菌圈直徑＞30 mm 為敏感（S）、20～30 mm為中介（I）、＜20 mm為耐藥（R）。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌純化培養(yǎng)及鏡檢

分離菌在TSA培養(yǎng)基上長(zhǎng)出表面光滑隆起、圓形、濕潤(rùn)、邊緣整齊、灰白色的菌落，大小為0.5～2 mm。革蘭氏染色為革蘭氏陰性短小菌，菌體呈單個(gè)的球狀、細(xì)長(zhǎng)桿狀、絲鏈狀，形體多樣化。

2.2 細(xì)菌NAD依賴(lài)性試驗(yàn)

分離菌營(yíng)養(yǎng)肉湯、普通瓊脂、TSA平板（不含小牛血清和NAD）培養(yǎng)基上均未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)，而在TSB培養(yǎng)基（含小牛血清和NAD）血瓊脂平板（含0.1%NAD）長(zhǎng)成半透明、露珠狀菌落，無(wú)溶血現(xiàn)象，且在含有NAD的TSB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，表明分離菌生長(zhǎng)需要NAD。

2.3 生化鑒定結(jié)果

分離菌氧化酶試驗(yàn)為陰性，過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)為陽(yáng)性；H2S、脲酶、靛基質(zhì)試驗(yàn)為陰性；發(fā)酵葡萄糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；不發(fā)酵賴(lài)氨酸、甘露醇。有23株分離菌符合Hps生化特征。

2.4 血清分型鑒定

血清分型試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在23株Hps分離菌中，有Hps血清1型7株，血清4型11株，血清5型2株，未定型3株。

2.5 PCR鑒定結(jié)果

利用特異性引物對(duì)分離菌株基因組進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到一條長(zhǎng)為822 bp 特異性條帶，符合預(yù)期擴(kuò)增目的大小，見(jiàn)下圖。綜合細(xì)菌培養(yǎng)特性、鏡檢、生化特性以及PCR鑒定結(jié)果，可判斷分離菌為Hps。

圖 分離菌株16S rDNA PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，23株分離菌對(duì)頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢噻肟敏感性較強(qiáng)，對(duì)其他抗生素均有不同程度耐藥性，其中對(duì)諾氟沙星、復(fù)方新諾明、磺胺嘧啶耐藥性最強(qiáng)，耐藥率分別為69.57%（16/23）、65.22%（15/23）、69.57%（16/23），見(jiàn)下表。

表 23株分離菌對(duì)抗生素敏感性檢測(cè)結(jié)果

3 討論

該次研究對(duì)來(lái)自長(zhǎng)垣市部分豬場(chǎng)疑似副豬嗜血桿菌病死豬的35 份病料進(jìn)行細(xì)菌分離純培養(yǎng)、鏡檢、生化試驗(yàn)以及PCR 鑒定，共得到23 株Hps，通過(guò)血清型鑒定，23株Hps血清分屬于1、4、5血清型及未定型血清，其中優(yōu)勢(shì)血清型為1 型占30.43%（7/23）和4 型占47.83%（11/23）。蔡旭旺等［4］報(bào)道，我國(guó)豬場(chǎng)Hps 優(yōu)勢(shì)流行菌株血清型主要為4、5、12 和13 型。該次血清型的鑒定可為今后Hps疫苗研制、菌株血清型的選擇提供參考。研究表明，長(zhǎng)垣市Hps 在豬場(chǎng)普遍存在，血清型比較多樣化，流行菌株復(fù)雜，應(yīng)引起重視。Hps 具有兼性厭氧和V 因子依賴(lài)性生長(zhǎng)的特點(diǎn)，其分離培養(yǎng)條件比較特殊。Hps 對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求很高，初次分離培養(yǎng)需要供給5%～10%的CO2促進(jìn)生長(zhǎng)，且其生長(zhǎng)需要V因子［5］。此外，病料采集盡量來(lái)自未使用抗生素治療的病豬和死亡時(shí)間在12 h 以?xún)?nèi)的病死豬。

不同地區(qū)、不同血清型Hps 菌株對(duì)同一類(lèi)抗生素的敏感性有所差異。藥敏試驗(yàn)可以檢測(cè)不同Hps 菌株對(duì)抗生素的敏感性，以便了解當(dāng)?shù)乜股刂委熜Ч瑸榕R床合理使用抗生素提供參考依據(jù)。目前，Hps 疫苗接種和抗生素是防控該病的主要有效措施，但是疫苗菌株與田間流行株存在差異，缺乏交叉保護(hù)，有可能導(dǎo)致免疫失敗。抗生素長(zhǎng)期濫用引起耐藥性增強(qiáng)以及細(xì)菌耐藥機(jī)制發(fā)生變化，使得抗生素選擇壓力越來(lái)越大。該研究中23 株分離菌對(duì)大多數(shù)抗生素均有耐藥性，僅對(duì)頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢噻肟敏感性較強(qiáng)。這可能與治療Hps 病選用抗生素有關(guān)，也可能與菌株在適應(yīng)環(huán)境生存中產(chǎn)生新的變異株有關(guān)。建議選用敏感性強(qiáng)的抗生素進(jìn)行防治，且交替使用抗生素，避免耐藥菌株發(fā)生。