用色譜法測(cè)定食物含量的研究

文 豐子萱 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)

1.葉黃素

葉黃素，屬于類胡蘿卜素中的一種，是人體無法制造的元素，必須通過外界攝取來獲得。對(duì)于心臟病以及冠狀動(dòng)脈疾病，還可起到預(yù)防心血管硬化，提高自身免疫力的作用，也可起到一定的抑制作用。同時(shí)，可防止玻璃體病變、預(yù)防黃斑病、保護(hù)眼睛、避免外界的光源對(duì)眼睛造成傷害，還是幫助眼睛健康的最重要的抗氧化劑，能有效避免視網(wǎng)膜受到氧化的傷害，對(duì)眼睛起到保護(hù)作用，所以對(duì)預(yù)防老年性眼球視網(wǎng)膜黃斑病變進(jìn)而引起的視力下降與失明。葉黃素高度集中在視網(wǎng)膜黃斑區(qū)，能有助保護(hù)其免受藍(lán)光的影響，為兒童稚嫩的眼睛起到特殊的保護(hù)作用，對(duì)兒童的視力發(fā)育極其有益，讓兒童順利形成對(duì)色彩的敏感感觸，從而維護(hù)人的正常視覺功能。牛奶除了含有其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還含有較高含量的葉黃素，而葉黃素的重要性在全球的營(yíng)養(yǎng)學(xué)界都得到了肯定，由于人體自身不能合成葉黃素，必須通過膳食攝入，如果膳食補(bǔ)充不足的話，也可通過營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化食品或補(bǔ)充劑的方式補(bǔ)充，所以人們可通過高營(yíng)養(yǎng)含量的膳食補(bǔ)充的方式來獲取人體需要的有益物質(zhì)，因此，牛奶中的葉黃素的提取就成為我們生活中獲取營(yíng)養(yǎng)的重要方法。

1.1 高效液相色譜法分析測(cè)定牛奶中的葉黃素

高效液相色譜法的特點(diǎn)：高壓、高效、高速，高沸點(diǎn)和熱不穩(wěn)性，有機(jī)及生化試樣的高效分離分析作用，比較氣相色譜法而言更為有用，更具發(fā)展前途。選取色譜柱時(shí)，首先需要考慮分離能力問題，C30與C18同為反向色譜柱，但C30柱有更好的分離能力，故本實(shí)驗(yàn)分離葉黃素可選用C30柱。

1.1.1 材料與方法

1.1.1.1 儀器與試劑

儀器：高效液相色譜儀、色譜柱、紫外可見光分光光度計(jì)、水浴鍋、電子天平、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、渦流混合器等。

試劑：甲醇、甲基叔丁基醚和二氯甲烷均為色譜純；丙酮和2，6-二叔丁基對(duì)甲酚均為優(yōu)級(jí)純；氯化鈉為分析純；葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞96.2%）。

1.1.1.2 工作原理

高效液相色譜法的原理是以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。

1.1.1.3 色譜條件

色譜柱：250mm×4.6mm

流動(dòng)相 A：甲醇

流動(dòng)相 B：甲基叔丁基醚

流動(dòng)相流速：1.0ml/min

檢測(cè)波長(zhǎng)：450nm

檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器

柱溫30℃；進(jìn)樣量20μl。

1.1.2 樣品制備

1.1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制

稱取各物葉黃素1.0mg，用流動(dòng)相（甲醇）定容為10mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)使用液配制

吸取上述標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液2.00mL于25mL棕色容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，混合均勻，配制成濃度分別為幾個(gè)梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.1.2.2 奶樣選取

取自內(nèi)蒙古某奶牛場(chǎng)，分裝于50mL離心管中；液體堿性蛋白酶（20萬-150萬U/g）；甲醇、甲基、叔丁基醚和二氯甲烷（色譜純）、氯化鈉（分析純）；試驗(yàn)用水均為超純水。

1.1.2.3 奶樣品前處理

從牧場(chǎng)取適量牛奶樣品后-20至-21℃貯存起來，檢測(cè)合格后，開始實(shí)驗(yàn)，將之前儲(chǔ)存好的奶樣品放入冷凍箱4℃解凍。用高速冷凍離心機(jī)（4℃、10000r/min）離心30min，小心刮取上層和離心管壁上的油脂，盡可能全部轉(zhuǎn)移于干凈的容器中，準(zhǔn)確記錄所用的牛奶樣品的體積V，并稱量所得油脂的重量M1。

1.1.2.4 牛奶樣品中葉黃素的提取

分為皂化、提取兩部分。準(zhǔn)確稱取3-5g油脂于50mL離心管中，加入10mL氯化鈉溶液（10%質(zhì)量濃度），再加入4mL液體堿性蛋白酶，用渦輪振蕩器振搖2min后，放到37℃水浴鍋中培養(yǎng)30min，加入10mL 正己烷，提取后將之輕搖排氣后置搖床上振蕩靜置分層，醚層用水洗至中性。叔丁基醚液經(jīng)過無水硫酸鈉脫水之后存入適宜容量的圓底燒瓶中，將其置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，繼續(xù)觀察，直至接近蒸干。使用叔丁基色譜純對(duì)甲酚定容，將其過濾，濾液準(zhǔn)備好進(jìn)樣。

1.1.3 結(jié)果分析

1.1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及譜圖

在上述液相色譜條件下測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，求出線性方程，可得出葉黃素保留時(shí)間，且無干擾。

最后，可多增加幾組平行試驗(yàn)保證重現(xiàn)性。

1.1.3.2 方法的檢出限

若稱樣量為1g，定容至25ml，進(jìn)樣量10μl，以3倍信桌比計(jì)算，檢測(cè)限為0.1μg/g。

1.1.3.3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜法測(cè)定牛奶中葉黃素的方法。該方法測(cè)定結(jié)果重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高、簡(jiǎn)單易操作、高效、高速、經(jīng)濟(jì)環(huán)保，適合用于葉黃素的日常檢測(cè)。

2.番茄

番茄作為人們?nèi)粘Ｉ钪械闹匾澄铮瑧?yīng)用無處不在，可以作為食物蔬菜，可以炒著吃、拌著吃、熬著吃，也可當(dāng)水果吃，還可作為中藥，加工成番茄醬。番茄含有對(duì)心血管起保護(hù)作用的維生素和礦物質(zhì)，可以減少心臟病的發(fā)作，番茄中的維生素C具有生津止渴、健胃消食、清熱解毒、降低血壓的功效，對(duì)高血壓腎臟病人有良好的輔助治療作用。多吃番茄具有抗衰老作用，使皮膚保持白皙。番茄紅素具有獨(dú)特的抗氧化能力，能清除自由基，保護(hù)細(xì)胞，使脫氧核糖核酸及基因免遭破壞，能阻止癌變進(jìn)程。西紅柿除了對(duì)前列腺癌有預(yù)防作用外，還能有效減少胰腺癌、直腸癌、喉癌、口腔癌、肺癌、乳腺癌等癌癥的發(fā)病危險(xiǎn)，經(jīng)常發(fā)生牙齦出血或皮下出血的患者，吃番茄有助于改善癥狀。番茄有諸多的好處，所以，對(duì)番茄的品控方面必須嚴(yán)格把關(guān)，這樣對(duì)番茄農(nóng)藥殘留檢測(cè)分析就成為從事食品工藝的人員重要工作內(nèi)容，確保上市產(chǎn)品的質(zhì)量安全。

2.1 色譜法檢測(cè)番茄中主要農(nóng)藥殘留

氣相色譜法檢測(cè)番茄中主要農(nóng)藥殘留的原理：不同物質(zhì)有不同沸點(diǎn)、極性、溶解度，且對(duì)同一種物質(zhì)有不同吸附性，故可利用此原理發(fā)出不同信號(hào)，并進(jìn)行轉(zhuǎn)換，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)混合物各組分進(jìn)行分組分離。

氣相色譜法優(yōu)點(diǎn)：有準(zhǔn)確率高、分析迅速的特點(diǎn)，且相對(duì)于同類檢測(cè)器選擇性、分離度更高，故一般使用此方法作為實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法。

2.1.1 測(cè)定準(zhǔn)備

儀器：色譜儀、電子天平、離心機(jī)、KS康氏震蕩器、水浴氮吹儀、分散勻漿基、冷凍離心機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器等。

試劑：使用有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品：毒死蜱、乙腈、100μg/mL甲基對(duì)硫磷、二嗪磷、氯化鈉、甲拌磷、美國(guó)Fisher丙酮、0.45μm過濾器、250μL進(jìn)樣針，以及試驗(yàn)期間使用的相關(guān)玻璃儀器。

農(nóng)藥殘留量順序：有機(jī)氯農(nóng)藥＞有機(jī)磷農(nóng)藥＞植物農(nóng)藥，故以有機(jī)氯農(nóng)藥為例子。

2.1.2 色譜分析條件

色譜柱：2m×2mm玻璃柱，填充料3%DC-200（或SE-30）涂于100-120目Gas Chrom Q上。

柱溫：175℃

汽化溫度：250℃

載氣：N 3mL·min-1

檢測(cè)器：ECD

不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.0μL，進(jìn)樣口溫度：220℃。

升溫溫度設(shè)置為110℃左右，保持2到2.5分鐘，再以每分鐘10℃的頻率增加溫度至220℃，保持2到2.5分鐘，再以每分鐘40℃的頻率升溫至260℃，保持4到4.5分鐘。

2.1.3 實(shí)驗(yàn)過程

2.1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)試劑配制

用移液槍吸取1 毫升的濃度為100μg/mL的各類型農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品在25mL容量瓶中，用Fisher丙酮定容，得到濃度為4μg/mL的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品。實(shí)驗(yàn)前，需要將標(biāo)準(zhǔn)品調(diào)用出來，用Fisher丙酮稀釋至標(biāo)準(zhǔn)濃度以配置成標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.3.2 番茄稀釋液的制作與曲線繪制

使用西紅柿空白樣品基質(zhì)液把農(nóng)藥混合溶液稀釋成不同倍數(shù)的混合液體，根據(jù)其數(shù)值繪制曲線，然后將稀釋后的各類標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行5到6次平行測(cè)驗(yàn)，讀出曲線峰面積，讀出組分質(zhì)量濃度，并尋找兩者相關(guān)度，分析曲線，得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.1.3.3 曲線繪制

分析結(jié)果可以時(shí)間為橫坐標(biāo)，不同溶劑為縱坐標(biāo)最終進(jìn)行分離。

2.1.4.舉例

選擇20mL乙腈作為提取液，同時(shí)在其中加入氯化鈉后，確定升溫程序參數(shù)為：7000r/min，同時(shí)將離心分層的溫度設(shè)定為15℃。在15分鐘內(nèi)成功對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行了分離分析，且可使此方法回收率達(dá)到百分之八十以上，檢出限達(dá)到0.02-0.04mg/kg，精密度達(dá)到3%-8%左右，符合現(xiàn)階段國(guó)家對(duì)番茄農(nóng)藥殘留提出出來的要求。

2.1.5 結(jié)論

氣相色譜法測(cè)定番茄中農(nóng)藥殘留具備著效率高、選擇范圍廣、高速、高選擇性的特點(diǎn)，能夠利用此方法對(duì)各類化合物進(jìn)行定性定量分析，將本文提出的農(nóng)藥殘留量分析方法應(yīng)用到現(xiàn)實(shí)大批量農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中，可以快速且準(zhǔn)確地檢測(cè)出農(nóng)藥殘留量。

總結(jié)

綜上所述，色譜法分析作為一種強(qiáng)大的分離技術(shù)和檢測(cè)手段在食品成分組分和食品質(zhì)量安全等方面得到廣泛的應(yīng)用，通過本文的兩種研究方法和實(shí)驗(yàn)對(duì)食品行業(yè)有著極大的促進(jìn)作用。