響應面優化富硒木耳制備工藝探討

文 賈志春 王金娟* 張建偉 .新疆理工學院 新疆黑木耳工程技術研發中心 .阿克蘇地區食品安全檢測中心

新疆阿克蘇本地的黑木耳品種作為富硒產品開發實驗對象，在前期單因素實驗的基礎上，利用Box-Benhnken中心組合旋轉實驗和響應面分析法，確定了制備過程的(硒添加量、溶液pH、滅菌溫度) 最適工藝條件。結果表明，制備富硒木耳的最佳工藝為：硒添加量102ug/g、溶液pH7.9、滅菌溫度100℃。在此工藝條件下，子實體總硒含量可達110.1mg/kg。通過在黑木耳菌種生長環節添加外源硒肥，測定最終子實體總硒含量，以期優化富硒黑木耳的制備工藝。

硒元素作為價值高的多功能生命營養元素之一，大多重要代謝酶所必需的微量元素之一，具有抗氧化、抗腫瘤、增強免疫力等作用，對人體健康具有重要意義；在一定范圍內低劑量使用可以對人體有益，超過食用范圍就會有副作用。在抵抗基體細胞氧化、衰老等方面與鍺元素有顯著協同效應；硒元素（Se）在自然界存在方式主要以常見的有機態和無機態兩種形式。常見的無機硒 Na2SeO4、亞硒酸 Na2SeO3等。無機硒吸收率低下、轉化率低、適口性較差，有一定毒副作用，所以適用范圍受限；源于食用菌子實體的硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸等毒性小，生物利用率高，則成為了人類從食物中獲得硒的重要來源。對于食用菌富硒研究方面，以高等食用真菌的耐硒、富硒能力的研究以及富硒多糖、蛋白的活性研究居多。目前已有將黑木耳、金針菇、平菇、香菇和猴頭菌等食用菌作為載體培育出富硒子實體。相對黑木耳的研究，大多在食用菌生物量的培養條件方面，對多糖和蛋白的提取也有大量探索。探索制備優化條件，以期為后期利用提供理論研究基礎和技術支撐。

1.材料與方法

1.1 材料與儀器

阿克蘇本地木耳栽培實驗菌種，硝酸（ρ1.42g/mL），鹽酸（ρ1.19g/mL），優級純。過氧化氫，亞硒酸鈉（Sigma-Aldrich，CAS No.：10102-18-8）、硒標準品（5%基體硝酸）。

電熱恒溫水浴鍋（HHS型，上海一恒科技有限公司，中國）；磁力加熱攪拌器（CJJ78-1型，金壇市恒豐儀器制造有限公司，中國）；雷磁酸度計（pHS-3C型，上海儀電科學儀器股份有限公司，中國）；集熱式磁力加熱攪拌器（DF-Ⅱ型，金壇市恒豐儀器制造有限公司，中國）；電子天平（JA2603B型，上海精科天美科學儀器有限公司，中國）；火焰原子吸收光譜儀(普析儀器）。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝方法

楊樹（干基）枝粉碎預處理→添加輔料，調適量水→添加亞硒酸鈉營養劑水溶液→基質充分混合均勻→最后調水。總含水量60%。調節混合料pH→及時裝袋→常壓滅菌10h得富硒黑木耳培養料→冷卻→接種→菌棒養菌→菌絲滿袋→打出耳口→擺棒、排場→出耳管理→采耳→干品檢測。

木耳基料配方：楊樹木屑70%（預處理）、麩皮12%、豆粉1.5%、花生麩1.5%、糖1.5%、CaCO31.5%，和生石灰1.5%，混合后，經過拌料4次，加入濃度不同硒肥，將硒肥溶于水中混合均勻后，調節pH值為7-9，裝袋，常壓滅菌，溫度為100℃，時間12-16h，冷卻即得富硒黑木耳培養料。

1.2.2 總硒的測定

稱取黑木耳干粉樣品，加7.0mL HNO3放置過夜，再加2.0mL H2O2，微波消解系統進行消化30min，冷卻后用少量超純水溶解，并定容到25.00mL，用火焰原子吸收光度法測定子實體含硒量。

1.3 響應面實驗

在前期單因素實驗基礎上，以富硒木耳制備的無機硒添加量、溶液pH、滅菌溫度作為響應子，子實體總硒含量為響應值，進行Box-Behnken的中心組合實驗設計，響應面實驗設計見表1。

表1 響應面實驗因素及編碼水平

2.結果與分析

2.1 響應面法確定制備富硒木耳的最佳工藝

根據 Box-Behnken 的統計設計原理，參考前期單因素實驗結果，采用響應面分析法對制備富硒木耳的工藝進行分析和優化，單因素實驗結果如表1所示。硒含量濃度（mg/kg），進行回歸分析得到關于無機硒添加量、溶液pH、滅菌溫度的三個因素的擬合二次項多項式方程：

總硒=110.29+6.97A+4.52B+1.24C-0.99AB-2.47AC-0.16BC-6A2-13.88B2-10.26C2

Design Expert7.0軟件分析結果中，模型的p值<0.0001，說明此模型統計學上具有顯著性。決定系數（R2）是0.9968，表明約有0.0032左右響應面變異性不能用這個數學模型來解釋。調整后的變異系數 R2adj=99.28% 大于預期確定系數95.92%，說明兩者有很好的相關性，且失擬項p=0.0805（p>0.05）不顯著，回歸顯著，其與純誤差沒有明顯相關性，說明模型的建立是合理的，在已知的變量范圍內都可以用本模型進行預測。

圖1顯示了當滅菌溫度為中心水平時，硒添加量、溶液pH對子實體總硒含量的交互作用。溶液pH一定時，子實體總硒含量隨著硒添加量呈現先增大后減小的趨勢；當硒添加量不變時，子實體總硒含量濃度隨著溶液pH也呈現先增大后減小的趨勢；硒添加量100-104ug、溶液pH在7.5-8.5之間時，子實體總硒含量有最大值。

表2 響應面分析方案及實驗結果

圖1 硒添加量、溶液pH 對子實體總硒含量的響應面圖

圖2顯示了當溶液pH為中心水平時，硒添加量、滅菌溫度對子實體總硒含量的交互作用。硒添加量一定時，子實體總硒含量隨著滅菌溫度呈現先增大后減小的趨勢；當滅菌溫度不變時，子實體總硒含量濃度隨著硒添加量也呈現先增大后緩慢減小的趨勢；硒添加量100-104ug、滅菌溫度在96-102℃之間時，子實體總硒含量有最大值。

圖2 硒添加量、滅菌溫度對子實體總硒含量的響應面圖

表3 響應面模型的方差分析

圖3顯示了當硒添加量為中心水平時，滅菌溫度、溶液pH對子實體總硒含量的交互作用。溶液pH一定時，子實體總硒含量隨著滅菌溫度呈現先增大后減小的趨勢；當滅菌溫度不變時，子實體總硒含量濃度隨著溶液pH也呈現先增大后減小的趨勢；硒添加量100-104ug、溶液pH在7.5-8.5之間時，子實體總硒含量有最大值。

圖3 滅菌溫度、溶液pH 對子實體總硒、含量的響應面圖

2.2 驗證性實驗

由軟件自動分析可得到富硒木耳制備工藝最佳理論值：硒添加量102.25ug/g、溶液pH7.89、滅菌溫度99.60℃，子實體總硒含量112.601mg/kg。考慮實際操作方便，選取硒添加量102ug/g、溶液pH7.9、滅菌溫度100℃，進行3次平行實驗，最終子實體濃度為110.1mg/kg，與理論值較為接近，說明該數學模型的建立對富硒木耳制備具有可行性。

結論

通過單因素（添加量、溶液pH、滅菌溫度）三水平為實驗因素，以子實體總硒含量指標，利用響應面軟件對上述指標為響應值進行模型建立和模型預測，得制備富硒木耳最佳提取工藝條件分別為：硒添加量102ug/g、溶液pH7.9、滅菌溫度100℃，在此工藝條件下，子實體的總硒含量可達110.1mg/kg，相比理論值減少了2.2%。說明該數學模型對優化木耳子實體提取工藝可行，并為綜合利用阿克蘇本地資源開展富硒木耳資源提供了理論依據。