靜電紡膠原蛋白納米纖維的研究進展

韓洪帥 宋秘釗 王彥珍 李家鑫

（1.齊齊哈爾大學，黑龍江齊齊哈爾，161006；2.寒區(qū)麻及制品教育部工程研究中心，黑龍江齊齊哈爾，161006）

納米纖維因具備尺寸效應和表/界面效應而廣泛應用于生物醫(yī)用、食品包裝、吸附過濾、傳感等領域［1-2］，采用靜電紡絲法制備具有成本低廉、生產設備簡單、工藝可控等優(yōu)點［3］。隨著技術的發(fā)展，靜電紡絲用原料趨向多元化，如天然高聚物（纖維素、蛋白質、多糖等）和合成高聚物（聚乙烯醇、聚己內酯、聚乳酸等）。其中膠原（Col）作為蛋白質的一種，是天然的生物大分子材料，而且具有良好的生物相容性、低免疫原性、可降解性、可吸收性，在止血、傷口愈合、藥物緩釋載體和組織工程等方面有廣泛應用。靜電紡膠原蛋白納米纖維比表面積大，孔隙率高，具有良好的生物相容性，含有大量的活性基團、模擬細胞外基質，兼具納米纖維的結構特征和膠原蛋白的化學特征，是理想的生物醫(yī)用材料，具有良好的發(fā)展前景。應用于生物組織工程中的靜電紡納米纖維要具備安全性好和毒性低等特點［4］。膠原蛋白在受到青睞的同時也存在一些問題，比如異種膠原蛋白引起的細胞免疫反應，殘存溶劑以及交聯劑的毒性問題尚未完全解決，膠原蛋白納米纖維材料的應用還處于初級階段［5］，尚未有臨床應用的報道。本研究對靜電紡膠原蛋白納米纖維的改性方法及其在生物醫(yī)用領域的應用技術進展、相關問題作以總結分析，旨在為該方面的技術研究工作提供參考。

1 靜電紡絲用膠原蛋白的來源

膠原蛋白材料來源豐富，廣泛存在于動物組織中，如肌腱、骨骼、皮膚、魚鱗、內臟等，而膠原蛋白的提取方法也較多，有酶法、酸法、鹽法、堿法、熱水法等［6-7］。其中鹽法是利用不同類型的膠原蛋白溶于不同濃度的鹽，常用于膠原蛋白的分離純化；熱水法是高溫破壞膠原蛋白中的共價鍵和氫鍵，導致膠原蛋白變性，常用于明膠的制備。通常使用兩種或兩種以上方法提取膠原蛋白，如酸酶復合提取法，不僅效率高，而且效果好。

1.1 肌腱

牟玉潔［8］利用酸酶復合提取法從牛跟腱中提取膠原，用六氟異丙醇溶解膠原后采用靜電紡方法制備納米纖維膜，經生物學評價，材料的細胞毒性為0級，SEM 結果顯示細胞能在膜上黏附伸展，并表現出增殖特征，表明制備的紡絲膜具有良好的細胞相容性和生物學特性，同時檢測發(fā)現纖維膜與動物血液具有良好的相容性，符合國家生物醫(yī)藥制品標準。趙林雙［9］以牛肌腱膠原為材料，聚氧化乙烯（PEO）為助紡劑，HFIP和乙酸（1∶1）混合溶液為溶劑，靜電紡制備出不同濃度的膠原/PEO膜，測得牛肌腱膠原基納米纖維膜具有納米級纖維結構，能夠模擬人體細胞間質的結構特征，具有較高的細胞相容性。

1.2 骨組織

甘文梅等［10］用酸酶復合提取法從牛骨中提取膠原蛋白，經戊烷/己烷進行脫脂、乙二胺四乙酸脫鈣處理后，采用醋酸和胃蛋白酶提取牛骨膠原蛋白，利用響應面法優(yōu)化了提取工藝，發(fā)現牛骨中含有豐富的I型膠原蛋白，可用于醫(yī)療領域。HOU C L等［11］利用羊骨提取膠原蛋白，將其與殼聚糖（CS）共混成膜，結果表明膠原蛋白與CS形成分子間氫鍵和靜電作用，提高了膜的拉伸強度，而且添加CS后，復合膜更加光滑、堅韌、透明，兩者共混具有良好的抗菌性、成膜性和力學性能。從動物骨中提取膠原蛋白工藝復雜，膠原提取率和純度都較低，利用骨膠原蛋白進行靜電紡絲的研究較少，需要加大對靜電紡骨膠原蛋白納米纖維膜制備與改性的研究。

1.3 動物皮

王彥珍等［12］利用羊皮作為原材料，用鹽酸提取羊皮膠原蛋白，用甲酸/乙酸混合液作為溶劑，利用靜電紡成功制備羊皮膠原蛋白/聚乙烯醇復合納米纖維膜，其吸水性高，成纖性好，熱穩(wěn)定性較高。DONG B等［13］以牛皮中的膠原蛋白為材料，以六氟異丙醇作為溶劑、磷酸鹽緩沖溶液為良溶劑，制備膠原蛋白納米纖維支架，紅外光譜表明靜電紡絲后膠原蛋白的三重螺旋結構得以保留。

雖然從牛、羊等哺乳動物體內提取膠原工藝簡單，膠原含量多，但是哺乳動物具有感染和傳播流行性疾病的風險，因此魚類膠原蛋白被認為是一種哺乳動物膠原蛋白的替代品。王佳冕［14］利用酸酶復合提取法從林蛙皮中提取膠原蛋白，以六氟異丙醇作溶劑靜電紡制備膠原納米纖維膜，經細胞學評價，其符合人成纖維細胞的生長特性，且對細胞增殖有一定的促進作用，有助于創(chuàng)口愈合。LI D S等［15］以羅非魚皮膠原為材料制備了靜電紡膠原蛋白納米纖維膜，研究得出提取的膠原為I型膠原蛋白，膠原納米纖維材料具有良好的生物相容性和低免疫原性。

1.4 人工合成膠原蛋白

從動物組織中提取的膠原蛋白應用廣泛，但其難以修飾，并且存在著細胞免疫的潛在風險，人工重組合成膠原蛋白成為一種新的途徑［16］。類人膠原蛋白是人工重組合成膠原蛋白的典型代表，已成功制備［17］。類人膠原蛋白是將人體膠原蛋白的信使核糖核酸逆轉錄成互補脫氧核糖核酸，經酶切后的一段基因重組于大腸桿菌內，經過高密度發(fā)酵、分離、復性、純化工藝生產的一種高分子生物蛋白［18］。類人膠原蛋白無毒無刺激，零風險，可用于組織工程等醫(yī)用領域。此外，還有人工化學合成膠原蛋白，KUMAR V等［19］利用36個氨基酸殘基膠原，模擬多肽自組裝設計膠原納米纖維，研究發(fā)現自組裝膠原納米纖維具有三螺旋結構，具有良好的生物兼容性，可以黏附和激活血小板形成凝塊，不引起感染，這種人工合成仿生膠原纖維具有促進愈合的作用，可用于止血。

2 靜電紡膠原蛋白納米纖維的改性方法

膠原具有優(yōu)良的生物相容性，可降解可吸收，但天然膠原蛋白力學性能差、易降解、可紡性低，影響了膠原蛋白納米纖維材料在生物醫(yī)用領域的應用。為此，研究人員對膠原蛋白進行改性，以提高其力學性能、可紡性、熱穩(wěn)定性和彈性模量，常見的膠原蛋白改性方法有交聯改性和共混改性［20］。

2.1 交聯改性

交聯改性是指通過共價鍵在膠原分子內和分子間結合實現提高膠原分子穩(wěn)定性的方法。常采用戊二醛、碳二亞胺、京尼平等化學試劑對膠原蛋白進行化學交聯改性［21］，常采用熱處理法、紫外線法、脫水法等物理方法交聯改性。

2.1.1 化學交聯改性

戊二醛的醛基可與膠原分子的伯氨基形成席夫堿，交聯后的納米纖維膜拉伸強度、熱穩(wěn)定性、抗水解能力都有明顯提高。石鑫［22］在仿去上皮羊膜的研究過程中，首先使用靜電紡技術制得膠原基納米纖維膜，再采用戊二醛對復合薄膜進行交聯，發(fā)現交聯提高了復合膜的透明度、彈性模量以及可操作性。但是醛類交聯劑存在細胞毒性問題，作為膠原蛋白納米醫(yī)用纖維的改性交聯劑使用存在安全隱患，因此有學者研究超臨界二氧化碳萃取技術去除膠原蛋白殘留的戊二醛或其他交聯試劑，結果顯示戊二醛濃度降低了95%以上，僅需1 h即可完成；此外CO2處理對膠原膜的熱穩(wěn)定性影響不大，卻顯著提高了薄膜的硬度和拉伸強度［23］。

碳二亞胺對膠原蛋白的交聯是通過在醛基和氨基之間形成酰胺鍵完成的，而且碳二亞胺能夠促進細胞的黏附增殖。趙新哲等［24］使用靜電紡制備膠原基納米纖維膜，通過碳二亞胺鹽酸鹽對其進行交聯改性，結果表明纖維膜在液態(tài)環(huán)境下浸漬7 d后仍能保持良好的納米纖維形態(tài)，纖維的溶脹率不高于180%；交聯改性后的纖維膜拉伸強力增加50%，力學性能得以改善；溶血試驗發(fā)現未對紅細胞造成損傷，凝血指數降低至20%。

京尼平（GP） 可與膠原蛋白的游離氨基發(fā)生席夫堿反應，而且GP是梔子苷經β-葡萄糖苷酶水解后的產物，是一種優(yōu)良的天然交聯劑，其毒性遠低于戊二醛等化學交聯劑。LUO X S等［25］采用京尼平（GP）、N-（3-二甲氨基丙基）-N′-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽/N-羥基磺基丁二酰亞胺（EDC/NHS）和戊二醛（GTA）作為交聯劑靜電紡膠原纖維，發(fā)現3種交聯劑都可以有效地維持納米纖維形態(tài)，改善了干、濕兩種狀態(tài)下的力學性能，尤其是EDC/NHS交聯改性后具有較大的極限拉伸應力；在細胞評價中，3種改性纖維支持小鼠胚胎成骨細胞的黏附、擴散和增殖，但GTA交聯改性纖維的細胞活力相對較低，而GP交聯改性纖維的細胞相容性更高。可以選取京尼平以及碳二亞胺鹽酸鹽類交聯劑改性膠原蛋白納米纖維膜。

2.1.2 物理交聯改性

物理交聯改性膠原蛋白的方法相比于化學交聯方法無毒無污染，不過交聯效果弱一些。趙林雙選取牛肌腱膠原靜電紡絲膜進行熱交聯，研究表明熱交聯后的牛肌腱膠原靜電紡絲膜纖維直徑變小，力學性能有較大程度的增強，但是水溶解性能并未有效改善。董鵬飛［26］采用靜電紡絲法制備膠原基納米纖維進行藥物可控性釋放研究，對膠原納米纖維進行紫外線交聯改性，經測試紫外交聯沒有破壞纖維的形貌，并且提高了膜的耐水性和拉伸強力，改性膠原納米纖維吸水率較低，比純膠原纖維降低了11.78%，拉伸強度是原來的兩倍。

2.2 共混改性

膠原蛋白納米纖維作為生物醫(yī)用材料對缺損組織的修復、再生及重建有著重要作用，需求量巨大，單獨紡膠原蛋白納米醫(yī)用纖維已經滿足不了應用需求，因此開始了共混紡絲研究，即依據應用需求選擇合適的材料與膠原混紡以期滿足使用要求，而且相較于化學交聯劑，物理共混安全無毒，復合納米纖維材料性能優(yōu)良。

2.2.1 膠原蛋白與天然高聚物共混紡絲

崔新愛［27］采用靜電紡絲法制備膠原蛋白和絲素蛋白復合納米纖維支架，發(fā)現最佳復合比為1∶1，而且絲素蛋白的加入明顯改善了膠原納米纖維的強度和韌性，復合膜的平均斷裂強度為7.32 MPa，平均斷裂延伸率為3.98%。SIONKOWSKA A等［28］將鼠尾肌腱膠原與殼聚糖共混進行靜電紡絲，發(fā)現在成膜過程中膠原蛋白的羥基、氨基、羧基能與殼聚糖的氨基和羧基形成分子間氫鍵相互作用，而且殼聚糖的氨基在酸性環(huán)境下容易被質子化形成氨基正離子并與呈陰離子性的膠原形成靜電作用，力學性能得到顯著提高，表明膠原和殼聚糖是可混溶的，在分子水平上相互作用形成新的氫鍵網絡，從而改變了膠原的螺旋特性以及共混物的特性。JELENA R K等［29］選擇80%彈性蛋白和20%膠原蛋白靜電紡納米纖維支架，發(fā)現膠原復合支架可以促進真皮成纖維細胞的增殖以及提高細胞遷移率，并且在小鼠皮下植入的耐受性良好，可持續(xù)6周以上，支架支持成纖細胞浸潤、新生膠原沉積和新的毛細血管形成，有望成為理想的真皮替代物。

2.2.2 膠原蛋白與合成高聚物共混紡絲

林童［30］采用靜電紡制備林蛙皮膠原蛋白和左旋聚乳酸（PLLA）復合納米纖維膜，發(fā)現隨著PLLA的增加，復合納米纖維的彈性模量增大，表面張力增加，硬度隨之降低，研究得出復合膜能滿足人體特殊部位對創(chuàng)傷敷料的需求。MIOARA D等［31］用靜電紡制備聚對苯二甲酸乙酯/膠原蛋白復合納米纖維，研究發(fā)現，與純膠原蛋白納米纖維相比，復合納米纖維的力學性能和彈性模量顯著提升，且不具有細胞毒性。LIN H Y等［32］將聚乙烯醇（PVA）與膠原蛋白復合后靜電紡制備納米纖維膜，發(fā)現PVA的加入顯著提高了納米纖維的斷裂伸長率以及斷裂強度，體外生物相容性更好，膠原纖維與聚乙烯醇纖維縱橫交錯形成更加穩(wěn)固的纖維網結構。

隨著生活水平的提高，消費結構呈現多元化和個性化，醫(yī)用膠原產品的市場需求呈現快速增長的趨勢。為了進一步提高膠原納米纖維的性能，學者開始將共混紡絲與交聯改性相結合，選擇合適的共混材料以及交聯方法成為研究重點。趙新哲［33］采用天然抗菌劑殼聚糖（CS）、聚環(huán)氧乙烷（PEO）和膠原（Col）三者共混靜電紡Col/CS/PEO納米纖維膜，既滿足止血、透氣、保濕功能，又能阻止細菌感染、促進傷口愈合和防止敷料黏連，然后又將Col/CS/PEO復合納米纖維膜用EDC/NHS交聯劑交聯改性，經過測試得出納米纖維膜在液態(tài)環(huán)境下結構穩(wěn)定，拉伸性能、凝血性能及細胞增殖性能顯著提升。

3 靜電紡膠原蛋白納米纖維的應用前景

在國內，一些膠原類生物材料已獲國家食品、藥品監(jiān)督管理機構的批準，并應用于食品、藥品、美容、止血材料等領域，在國外該類產品也獲認證與批準。但膠原基納米纖維材料起步晚，缺少臨床試驗，在生物醫(yī)用纖維中應用較少。靜電紡膠原納米纖維比表面積大，孔隙率高，可降解，可吸收，含有活性基團，在止血材料、藥物緩釋載體、生物組織工程支架等領域具有應用前景。

3.1 止血材料

3.1.1 醫(yī)用縫合線

KARINA D S等［34］將 聚 乳 酸-羥 基 乙 酸（PLGA）和牛骨膠原蛋白復合，利用尖端誘導共軛效應靜電紡納米纖維紗線，并添加麻瘋樹葉提取物增加其抗菌性，試驗顯示所有樣品的活細胞百分率均在50%以上，抑菌帶在5 mm～10 mm；最佳樣品在浸泡60 d的降解率為82.2%。可見PLGA/Col/麻瘋樹提取物復合紗線安全無毒，有抗菌止血功能，可作為可吸收外科手術縫合線。

3.1.2 創(chuàng)傷敷料

尚柯［35］采取添加銀離子靜電紡制備膠原基納米纖維，發(fā)現結合有抗菌劑的膠原纖維敷料不僅止血時間短，而且對幾種代表性的致病菌都具有良好的抗菌效果。JEONG I K等［36］用靜電紡制備膠原蛋白/聚己內酯（PCL）復合納米纖維膜，發(fā)現具備高孔隙率和納米拓撲結構的膠原蛋白/PCL納米纖維膜適于細胞的黏附、生長、繁殖，大鼠體內開放性傷口愈合試驗顯示納米纖維膠原蛋白覆蓋創(chuàng)面愈合效果與紗布覆蓋創(chuàng)面相似，而膠原蛋白組早期愈合速度更快。

3.2 藥物緩釋載體

SUNDAR S S等［37］采用靜電紡制備膠原蛋白/聚丙烯酰胺/殼聚糖與抗癌藥物5-氟尿嘧啶復合物，殼聚糖濃度的增加延緩了藥物從纖維網絡的釋放，聚丙烯酰胺的加入提高了模型的血液相容性，該復合材料在腫瘤治療領域具有巨大價值，可作為腫瘤手術后治療的藥物傳遞劑和血液接觸生物材料。國內學者也研究發(fā)現，膠原作為5-氟尿嘧啶藥物的載藥基體，藥物突釋現象明顯減少，增加了藥物的利用率，有效降低了副作用［38］。郭慧文等［39］以膠原和聚氧化乙烯為核層材料，殼聚糖和聚氧化乙烯為殼層材料，采用同軸靜電紡技術成功制備出核-殼結構納米纖維，并將質量分數為5%的鹽酸環(huán)丙沙星負載到核層以提供抗菌性能，通過藥物體外釋放試驗發(fā)現，核-殼納米纖維膜負載藥物釋放緩慢，24 h才釋放約25%，為負載藥物提供新的方法與思路。

3.3 生物組織工程支架

支架最早出現于20世紀后期，先后經歷了第一代的金屬支架、第二代的藥物涂層支架和最新的生物可吸收支架等不同的歷程，現在應用最廣泛的是第二代藥物涂層支架。而膠原納米纖維支架可降解可吸收，具有模擬細胞外基質的功能，有良好的生物相容性以及低免疫原性，使細胞能夠黏附在生物材料上進行擴增，從而達到修復組織的目的，同時三維纖維支架中多孔網狀結構提高了支架的穩(wěn)定性和細胞相容性［40］。

3.3.1 骨支架

骨組織的主要成分是膠原蛋白、磷酸鈣和成骨細胞，當骨組織缺損或病變時需要替換骨組織，其中自體骨移植供給有限且會造成二次傷害，異體骨有感染疾病風險及免疫排斥等問題，因此利用膠原蛋白合成人工骨受到廣泛應用。目前臨床試驗上利用靜電紡絲法制備膠原類骨支架具有更好的生物相容性及降解性，誘導成骨細胞的生長和自體骨的合成。EKAPUTRA A K等［41］成功將豬骨髓間充質干細胞（pBMMCs）包裹在聚ε-己內酯（PCL）和膠原納米復合支架上，可以在纖維網上黏附和增殖，發(fā)現在動態(tài)條件下培養(yǎng)這些結構體可增強骨樣組織形成和機械強度。王思青等［42］用靜電紡絲法制備膠原/PCL/納米鋯酸鈣（n CZ） 和膠原/PCL/納米羥基磷灰石（n HA）復合支架，與人牙周膜細胞（PDLCs）共培養(yǎng)，發(fā)現前者復合支架具有更加優(yōu)良的力學性能和生物相容性，具備成骨誘導的潛力，而且可以被組織吸收，減少炎癥反應。

3.3.2 心臟瓣膜支架

心臟支架要安全無毒，無免疫反應，同時具備一定的力學性能。陳銳［43］利用聚氨酯和膠原蛋白靜電紡復合納米纖維，從結構和功能上仿生天然心臟瓣膜組織細胞外基質，在改變培養(yǎng)液流速和培養(yǎng)時間的情況下，細胞在支架上的黏附繁殖能力較好，結果表明靜電紡支架可以為細胞提供一個良好的生長空間，外部剪切應力不影響細胞正常生長。MARIA K等［44］采用靜電紡膠原納米纖作為心臟補片，心肌細胞在纖維支架上呈現三維生長態(tài)勢，用擴張型心肌病小鼠進行試驗，發(fā)現支架的生物相容性良好，植入兩周后未見明顯炎癥，抗原性較低。

3.3.3 血管支架

血管移植工程是再生醫(yī)學的一個新興領域，JIA W B等［45］制備膠原-透明質酸寡糖（Col- HA）納米纖維支架，試驗表明，支架能夠促進豬髂動脈內皮細胞增殖，具有促進血管內皮分化潛能，是血管組織工程內層支架的較好選擇。IFFA A F等［46］將PLLA、CS和膠原蛋白共混，靜電紡制備血管工程導管，發(fā)現導管抗張強度大、爆破壓均在原生血管的數值范圍內，符合血管移植材料高血液相容性和低細胞毒性的要求。

3.3.4 角膜支架

WU Z J等［47］將聚醋酸乙烯酯（PVAc）和膠原蛋白復合靜電紡絲，以增強膠原蛋白靜電紡絲支架的機械強度，發(fā)現人角質細胞和人角膜上皮細胞黏附和增殖良好，定向納米纖維誘導人角質細胞有序生長，適用于組織工程角膜。

靜電紡膠原基納米纖維在生物組織工程支架中表現出良好的應用潛力，試驗表明細胞可以在支架上黏附、增值，而選取合適的膠原基納米纖維支架和生物細胞發(fā)揮協(xié)同作用尤為重要。但是研究多為體外試驗，后期纖維支架試驗還需進一步優(yōu)化。

4 結語

隨著科技的發(fā)展，選用魚類膠原蛋白以及類人膠原蛋白可以降低乃至避免異種膠原蛋白的傳染性疾病以及免疫原性，更適合膠原蛋白納米纖維在生物醫(yī)用領域的應用。靜電紡膠原蛋白的溶劑可以選擇類似乙醇/磷酸鹽緩沖溶液的中性鹽溶液，減少對膠原的破壞以及毒性問題。在膠原改性方面，利用膠原蛋白與有機高分子靜電紡絲制備復合納米纖維膜，既結合了膠原的生物相容性、可降解性、低免疫原性，又結合了有機高分子優(yōu)異的力學性能、成膜性，同時選用低毒無毒的交聯改性方法（京尼平、碳二亞胺鹽酸鹽）提高膜的物理性能，可仿天然細胞外基質，在止血、藥物載釋、骨再生、真皮替代物等生物醫(yī)療領域具有發(fā)展?jié)摿ΑＤ壳皣鴥韧饫渺o電紡絲技術制備膠原蛋白納米纖維還處于實驗室階段，工藝參數以及紡絲設備還不成熟，工業(yè)化制備較少，膠原納米纖維材料的臨床試驗與臨床應用缺乏。需要繼續(xù)改進靜電紡絲工藝，深入研究膠原基納米纖維的結構調控，重點研究膠原納米纖維的臨床試驗與臨床應用，以滿足生物組織工程的需求。