機械損傷對人氣道上皮細胞生長的影響

賴燕婷 曾惠清 張孝斌

良性氣道狹窄指因各類良性病變引起的氣道狹窄，臨床表現為咳嗽、反復呼吸道感染、不同程度的呼吸困難甚至窒息。成人良性氣道狹窄常見病因為結核、氣管插管和氣管切開術后氣道狹窄[1-2]。隨著重癥醫學和呼吸支持技術的發展，接受氣管插管、氣管切開的病人數量上升，其導致氣道狹窄的發生率升高[3]。據報道氣管插管2周左右、拔管后1個月左右即可發生氣管狹窄[4]。相較于惡性氣道狹窄，良性氣道狹窄患者生存期長、遠期并發癥多，反復住院，生活質量差，越來越受到人們的關注，已成為研究熱點。本研究旨在通過機械劃痕模擬氣管插管對氣道損傷作用，通過測量造模后細胞生長情況，在細胞水平層面探討機械損傷對氣道上皮細胞的作用，探討氣管插管所致氣管狹窄可能的發生發展機制。

資料與方法

一、實驗材料

人支氣管上皮細胞(16HBE)、16HBE專用完全培養液外購于賽百慷公司。DMEM培養基購于hyclone公司；DAB顯色試劑盒、(Mouse/Rabbit)IHC Kit購于福州邁新；CCK8試劑盒購于Biosharp；TGF-β抗體購于bioss公司；β-catenin抗體購于abcam公司；HIF-1α抗體購于proteintch公司；蘇木精染色劑購于SIGMA公司。本研究倫理審批號：xmzsyyky論審第(2021-065)號。

二、細胞培養

三、細胞造模

本課題組參照文獻報道的方法[5-6]，建立上皮細胞機械損傷模型。具體步驟如下：16HBE細胞100%融合后進行換液，然后用20μL的槍頭在單層細胞上以間隔縱橫劃8條寬約0.5mm缺口，無血清培養基培養3 h后棄去，加新鮮的無血清培養基繼續培養24h，將培養后上清液加入16HBE專用完全培養液建立條件培養液。

四、HBE細胞處理

將16HBE分為2組，每組各設置3個亞組進行重復試驗，其中A1組用16HBE專用完全培養液培養，A2組用條件培養基培養，培養5天，倒置熒光顯微鏡觀察各組細胞的形態。

五、細胞增殖活性及細胞分子檢測

1 CCK8法檢測細胞增殖情況

細胞按照3000個/孔,鋪板96孔板，待細胞貼壁后分組進行處理。處理48 h后，丟棄舊的培養基，加入CCK8試劑進行細胞活力檢測，2h內讀取OD450值。具體步驟參照各種試劑說明書進行。

2 免疫細胞化學

利用免疫細胞化學檢測處理后16HBE中TGF-β、β-catenin、HIF-1表達水平。具體步驟如下：1)阻斷、滅活內源性過氧化物酶；2)正常羊血清工作液封閉非特異位點；3)相應細胞因子一抗、二抗孵育；4)DAB反應染色、蘇木素復染、脫水透明，中性樹膠封片；5)拍照存檔。具體步驟參照各種試劑說明書進行；各抗體工作濃度按說明書進行稀釋。

3 HE染色

蘇木精-伊紅染色方法對細胞處理后16HBE進行染色；具體步驟均參照各種試劑說明書進行。

材料中“黨的十八屆會議審議通過《建議》”體現中共的相應知識點，比如：執政黨、領導核心、執政方式；“國家發改委啟動建言獻策活動”體現公民參與民主決策；“政府編制‘十三五’綱要”體現政府科學民主決策等等。通過分析，既把握材料的中心思想和層次性，又建立了與知識點的聯系。

六、統計學分析

采用 SPSS 22.0軟件進行統計學分析，兩組間比較用t檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、細胞基礎培養

人支氣管上皮細胞16HBE基礎培養生長情況(圖1)所示，細胞生長狀態良好。

圖1 細胞基礎培養生長情況(×100)

二、16HBE細胞造模

16HBE造模前后生長情況，細胞生長狀態良好(圖2)所示。

圖2 細胞造模前后生長情況(×100)

三、16HBE細胞處理后生長情況

將16HBE分組培養5天后，倒置熒光顯微鏡觀察各組細胞的形態，兩組細胞均表現為扁平、核大而圓、形態不規則，細胞間彼此連接緊密，細胞連接處清晰可見，(圖3)所示。

四、細胞計數

將16HBE分組培養后進行細胞計數，各組數量比較(圖4)所示，造模后，細胞數量顯著降低(P<0.05)。

圖3 人支氣管上皮細胞(16HBE)分組培養后細胞生長情況(×100)

圖4 人支氣管上皮細胞(16HBE)分組培養后細胞數量對比

五、CCK8檢測

將16HBE分組培養后用CCK8檢測法分析兩組細胞增殖情況，結果(圖5)所示，造模后，細胞活性顯著降低(P<0.05)。

圖5 人支氣管上皮細胞(16HBE)分組培養后CCK8法檢測細胞增殖活性(OD450吸光度對比情況)

六、免疫細胞化學

將16HBE分組培養后免疫細胞化學分析TGF-β、β-catenin、HIF-1表達情況，使用Image J軟件分析組化圖像，結果(圖6)所示，原圖(圖7)所示。結果顯示，造模后TGF-β、β-catenin、HIF-1α表達升高(P<0.05)。

圖6 人支氣管上皮細胞(16HBE)分組培養后免疫細胞化學測定細胞因子結果

圖7 16HBE細胞分組培養后免疫細胞化學DAB染色(×400)

七、HE染色

將16HBE分組培養后，HE染色顯微鏡下觀察細胞變化情況，造模后細胞形態未變，胞核染色未變，胞質淡染，結果(如圖8)所示。

討 論

氣管插管和氣管切開是導致氣道良性狹窄的主要病因，此類患者生存期長，生活質量差，醫療資源及經濟資源消耗大，越來越受到人們關注，其參與介導氣道狹窄的分子機制復雜，且關于這方面的基礎研究不足。

圖8 HE(蘇木精-伊紅染色)染色(×400)

良性氣道狹窄的發生是氣道粘膜損傷和異常修復的過程[7]，最終導致氣道重塑。當氣道粘膜破壞時，炎癥細胞浸潤、增生、分化，新生血管形成，其中成纖維細胞分泌大量膠原纖維，造成膠原沉積，肉芽組織老化脫水，成纖維細胞變成具有收縮表現的肌成纖維細胞，發生組織攣縮及瘢痕狹窄，在氣道狹窄中起重要作用。

氣道重塑過程中，TGF-β過度表達，促進成纖維細胞的募集及向肌成纖維細胞分化，細胞外基質過表達、沉淀和細胞外基質降解減少，參與氣道狹窄的形成。Simpson等[8]對聲門下氣道狹窄模型犬注射抗TGF-β，發現其可明顯減輕氣道狹窄，從動物層面驗證了TGF-β在氣道狹窄中的作用。隨訪119例氣管支氣管結核患者，氣管鏡評估氣管狹窄發生情況，分析血液TGF-β濃度，發現氣道狹窄組TGF -β水平較非狹窄組明顯升高[9]。國內學者一項關于大鼠氣管移植后移植體狹窄的研究發現，對比對照組，氣管移植體內TGF-β1表達量明顯增加,且其變化趨勢與上皮細胞間質轉化動態變化趨勢一致,其研究證明TGF-β/Smad信號通路參與氣管移植后移植體狹窄[10]。

TGF-β和Wnt都是調節上皮間質轉化(EMT)的重要通路，Wnt/β-catenin通路中當Wnt信號激活后可激活胞內蛋白DVL，抑制GSK3β等蛋白形成的β-catenin降解復合物的降解活性，穩定細胞質中游離狀態的β-catenin蛋白。β-catenin進入細胞核后結合LEF/TCF轉錄因子家族，啟動下游靶基因(如c-myc、Cyclin D1等)的轉錄，誘導EMT轉換，介導氣道重塑發生。在哮喘小鼠中, 通過抑制Wnt/β-catenin通路, 小鼠上皮下纖維化及膠原累積明顯減少, 氣道重塑程度明顯降低[11]。

HIF-1是一種低氧誘導結合蛋白，在低氧環境下，HIF-1α亞基的降解被抑制，1α和β亞基形成有活性的HIF-1，轉移到細胞核內調節多種基因的轉錄，包括VEGF的表達增強，參與炎癥反應。Cai[12]等人分析了24例氣管插管后氣道狹窄患者氣道增生組織中HIF-1α表達情況，發現HIF-1α在氣道肉芽組織中持續存在，參與氣管插管后氣道狹窄的發病過程，認為其可能是啟動和促進這一過程的潛在關鍵調節因子。

本研究通過機械劃痕模擬插管機械損傷，對氣道上皮細胞進行損傷造模，利用造模后培養基對氣道上皮細胞進行培養，對比細胞數及凋亡率，探討機械損傷對氣道上皮細胞增生的影響，結果顯示造模后氣道上皮細胞的生長速度減慢，且活性降低，差異具有統計學意義，說明機械損傷可抑制氣道上皮細胞的正常生長。免疫細胞化學進一步分析兩組細胞因子變化，發現造模后細胞TGF-β、β-catenin升高，差異具有統計學意義，提示機械損傷破壞上皮細胞后可產生無菌性炎癥，促發損傷修復機制，同感染性炎癥介導氣道重塑相似，導致炎癥性細胞因子TGF-β、β-catenin過表達，說明TGF-β及Wnt/β-catenin通路可能是機械損傷后氣道修復的作用機制。氣管插管對氣道粘膜造成機械損傷的同時，由于氣管插管套囊長時間壓迫，粘膜局部缺血缺氧，導致缺氧因子HIF-1過表達，本研究在細胞層面證實了機械損傷下HIF-1的升高，證實缺氧參與了機械損傷介導的炎癥反應。綜上，本研究認為機械損傷可抑制氣道上皮細胞的正常生長；缺氧及TGF-β、Wnt/β-catenin通路可能參與了氣道機械損傷后的修復過程。在此，我們提出假設，機械損傷可通過TGF-β、Wnt/β-catenin通路及HIF-1參與其氣道修復過程，抑制氣道上皮細胞的正常增殖，誘導氣道上皮細胞間質轉化，促進上皮重塑，導致氣道發生狹窄，這需要進一步行細胞及動物實驗進行驗證。