m6A修飾在膠質(zhì)瘤中的研究進(jìn)展

郭巖松 李思柔 李琳 曾昭穆 白澤通 溫稀超 鄭克彬

河北大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科（河北保定 071000）

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，主要來源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，約占所有原發(fā)性腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的28%，占所有惡性腫瘤的80%［1］。膠質(zhì)瘤分為1～4 級，1、2 級為低級別腦膠質(zhì)瘤，3、4 級為高級別腦膠質(zhì)瘤，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤惡性程度最高，患者5 年生存率極低，目前臨床上以手術(shù)切除輔以放療、化療、電場治療等綜合療法［2-3］，但其很難徹底切除，且很容易從原發(fā)腫瘤上脫離并穿過腦組織［4］，進(jìn)展快、對放化療抵抗且有較高的復(fù)發(fā)率。為了更有效地治療膠質(zhì)瘤，有必要了解膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制以及分子生物學(xué)特性。

近年來，隨著特異性抗體和高通量測序的快速發(fā)展，非編碼RNA 和RNA 的轉(zhuǎn)錄后修飾已成為當(dāng)前研究的活躍領(lǐng)域［5-6］。N6-甲基腺嘌呤（m6A）基因修飾作為分布最廣泛的RNA 修飾，在哺乳動物中也很顯著，其通過甲基轉(zhuǎn)移酶（“編寫者”）安裝、去甲基酶（“擦除者”）消除和結(jié)合蛋白（“讀取者”）識別來協(xié)調(diào)其功能［7］。m6A 修飾在包括癌癥［8］在內(nèi)的生理發(fā)育和病理過程中發(fā)揮著不同的作用，隨著研究的深入，其在膠質(zhì)瘤中所發(fā)揮的生物學(xué)作用和應(yīng)用不斷被發(fā)現(xiàn)，令我們對膠質(zhì)瘤有更進(jìn)一步的認(rèn)識，并為膠質(zhì)瘤的治療提供新方案。

1 m6A 修飾及作用機制

m6A 修飾主要發(fā)生在共有序列RRACH（R 表示鳥苷（G）或腺苷（A），H 表示A、胞苷（C）或尿苷（U））的腺嘌呤中［9］，廣泛分布于真核生物中。m6A 修飾主要由甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基酶和結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)，作為一種調(diào)節(jié)系統(tǒng)，最重要的就是其可逆性［7］。作為一種表觀遺傳學(xué)修飾，m6A 修飾通過調(diào)控基因表達(dá)在細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)功能。

1.1 甲基轉(zhuǎn)移酶（“編寫者”）甲基轉(zhuǎn)移酶起“編寫者”作用，使m6A 沉積在RNA 上。m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體是一個約1 000 kDa 的完整復(fù)合體，包含甲基轉(zhuǎn)移酶樣3、14 和16（METTL3/14/16）、E3泛素連接酶CBL1（HAKAI）、鋅指CCCH 結(jié)構(gòu)域13（ZC3H13）、KIAA1429（又稱VIRMA）、RNA 結(jié)合基序蛋白15 及其類似物（RBM15/15B）和Wilms 腫瘤相關(guān)蛋白（WTAP）［10-11］。METTL3 是最早發(fā)現(xiàn)的甲基轉(zhuǎn)移酶和甲基轉(zhuǎn)移酶的核心亞基，另一個關(guān)鍵酶METTL14 可與METTL3 相互作用［12］，形成一個穩(wěn)定的異源二聚體，表現(xiàn)出比單獨的METTL3 更高的m6A 安裝活性。結(jié)構(gòu)和生化研究表明，METTL3與SAM 結(jié)合，METTL14 通過提供RNA 結(jié)合支架在結(jié)構(gòu)上支持METTL3，從而提高其甲基化效率［13］。METTL16 是U6 剪接體小核RNA 的甲基轉(zhuǎn)移酶，SAM 同源穩(wěn)定所必需的。WTAP 是甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的第三亞單位，在哺乳動物中與Wilms 腫瘤1蛋白結(jié)合的剪接因子，在胚胎發(fā)育中起關(guān)鍵作用。雖然WTAP 對RNA 靶標(biāo)沒有催化活性，但它可以幫助METTL3-METTL14 異源二聚體定位在核斑點中，并促進(jìn)m6A 沉積［14］。在哺乳動物雌性發(fā)育過程中，RBM15/15B 的缺失導(dǎo)致了XIST 介導(dǎo)的X 染色體上的基因沉默，可作為m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的輔助因子［10］。VIRMA 招募并引導(dǎo)催化（METTL3/METTL14/WTAP）到m6A 甲基化的特定RNA 區(qū)域，同時HAKAI 也是組成甲基轉(zhuǎn)移酶的一部分［11］。在果蠅和小鼠中，發(fā)現(xiàn)ZC3H13 與Fl（2）d相關(guān)復(fù)合體成分相互作用，作為甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的輔助因子，控制果蠅性別決定中m6A 的總體水平［15］。

1.2 去甲基酶（“擦除者”）去甲基酶作為“擦除者”主要參與RNA 修飾的去甲基化過程，將RNA甲基化修飾信號“擦除”。α-酮戊二酸依賴的雙加氧酶B 同源物5（ALKBH5）或脂肪質(zhì)量和肥胖相關(guān)蛋白（FTO）可以使m6A 去甲基化是當(dāng)前所知的兩種m6A 特異性去甲基酶［16］。FTO 和ALKBH5 通過酮戊二酸和位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的二價鐵離子發(fā)揮作用，先氧化m6A 生成N6-羥甲基腺苷，然后轉(zhuǎn)化為N6-甲酰腺苷（F6A）。當(dāng)F6A 轉(zhuǎn)變?yōu)橄佘眨ˋ）時，便完成了去甲基化過程［17］。FTO 蛋白核心區(qū)與ALKB 蛋白家族相似，但它能夠使甲基化的單鏈DNA或RNA去甲基化，正是由于其C末端獨特的長環(huán)與ALKB 家族的其他蛋白不同［18］。ALKBH5和FTO 的表達(dá)水平有所不同，在小鼠中，ALKHB5主要在睪丸和雌性卵巢中表達(dá)，相比之下，F(xiàn)TO 主要表達(dá)于大腦中，這可能與它們參與的各種生化途徑有關(guān)［17-18］。

1.3 結(jié)合蛋白（“讀取者”）結(jié)合蛋白識別和結(jié)合RNA 上的m6A 或改變RNA 的結(jié)構(gòu)發(fā)揮m6A 在轉(zhuǎn)錄后基因修飾中的作用，并激活調(diào)控通路，如mRNA 降解和miRNA 加工，從而影響靶mRNAs 的表達(dá)［19-20］。結(jié)合蛋白包括YTH蛋白家族（YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1 和YTHDC2）、異質(zhì)核核糖核蛋白（HNRNPs）和胰島素樣生長因子2 mRNA 結(jié)合蛋白（IGF2BP），它們特異性地識別和結(jié)合靶RNA 中的m6A 位點［21］。大多數(shù)情況下，m6A 讀取者影響RNA 加工的分子機制，而不涉及對m6A 水平變化的調(diào)節(jié)［22］。在YTH 蛋白家族中，YTHDF1 提高了m6A 相關(guān)mRNA 的翻譯效率，YTHDF2 增強了m6A 修飾轉(zhuǎn)錄本的降解，YTHDF3通過與YTHDF1 相互作用來調(diào)節(jié)其靶RNA 的翻譯效率，并通過與YTHDF2 的協(xié)同作用來誘導(dǎo)RNA衰退［23-24］。

2 m6A 修飾在膠質(zhì)瘤中的生物學(xué)作用

m6A 對RNA 的內(nèi)部修飾被認(rèn)為是自然界中最普遍和最持續(xù)的RNA 改變，m6A 相關(guān)蛋白表達(dá)水平的高低在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮不同的生物學(xué)作用，深入了解m6A 修飾在膠質(zhì)瘤中的作用機制，尋找關(guān)鍵的靶基因，有助于膠質(zhì)瘤的基因靶向治療。

2.1 m6A 修飾參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展m6A 修飾不僅促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，而且起到抑制作用。在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)的ALKBH5，作為m6A 擦除者使靶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物G6PD 去甲基化，加強其mRNA穩(wěn)定性，促進(jìn)G6PD 的翻譯，從而激活磷酸戊糖途徑，促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)展［25］。此外，METTL3 通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵癌基因或抑癌基因轉(zhuǎn)錄本部位的m6A來影響腫瘤，如在GBM 中上調(diào)的METTL3 甲基化ADAR1 并增加其蛋白水平，然后ADAR1 通過結(jié)合CDK2 起到不依賴其脫氨酶活性的促癌作用［26］。m6A 修飾相關(guān)蛋白還發(fā)揮腫瘤抑制作用，如敲除FTO顯著促進(jìn)pri-miR-10a的m6A修飾，并被HNRNPA2B1 識別，通過招募DGCR8 進(jìn)一步促進(jìn)miRNA-10a 的成熟，從而靶向腫瘤抑制蛋白MTMR3 促進(jìn)GBM 細(xì)胞的惡性進(jìn)展。同時發(fā)現(xiàn)FTO 的轉(zhuǎn)錄活性可被轉(zhuǎn)錄因子SPI1 抑制，而敲除SPI1 可恢復(fù)FTO的表達(dá)，并抑制GBM 的進(jìn)展［27］。可見m6A 修飾在膠質(zhì)瘤的進(jìn)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

2.2 m6A 修飾參與膠質(zhì)瘤的侵襲轉(zhuǎn)移膠質(zhì)瘤具有強大的侵襲轉(zhuǎn)移能力，可浸潤?quán)徑M織、器官，甚至向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，m6A 修飾調(diào)控因子的異常表達(dá)可導(dǎo)致其侵襲和轉(zhuǎn)移能力的改變。上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程使細(xì)胞具有轉(zhuǎn)移和侵襲特性，并使細(xì)胞獲得啟動轉(zhuǎn)移的能力［28］。在EMT 過程中，E-鈣黏蛋白（E-Cad，CDH1）的丟失和N-鈣粘蛋白（N-Cad，CDh2）的上調(diào)被認(rèn)為是影響細(xì)胞黏附的最關(guān)鍵一步，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白減少也是腫瘤侵襲的重要原因。TAO 等［29］實驗表明在EMT 過程中，GBM 細(xì)胞的m6A RNA 水平較對照細(xì)胞顯著下降，ALKBH5 的上調(diào)和METTL3 的下調(diào)影響GBM 細(xì)胞MMP2、CDH1、CDH2 和FN1 的水平，促進(jìn)EMT 的進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲。此外，ALKBH5 的過表達(dá)還可以在體內(nèi)加劇GBM 的EMT 進(jìn)展。通過調(diào)控m6A 修飾的表達(dá)可起到抑制膠質(zhì)瘤侵襲轉(zhuǎn)移的能力，為GBM 的分子靶向治療提供新的參考。

2.3 m6A 修飾參與膠質(zhì)瘤的血管生成在腫瘤組織中有許多滋養(yǎng)血管，豐富的血供為其增殖提供了有力的營養(yǎng)支持，這對于低級別腫瘤向高級別轉(zhuǎn)變尤為關(guān)鍵，而且，血管生成與腫瘤惡性程度存在顯著的相關(guān)性。m6A 修飾能夠參與膠質(zhì)瘤的血管生成，如在膠質(zhì)瘤中依賴于METTL3 的m6A修飾增強了HOTAIRM1 的穩(wěn)定性，HOTAIRM1 通過上調(diào)IGFBP2 的表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞血管生成擬態(tài)（Vasculative Mimicry，VM）的形成，VM 可促進(jìn)惡性腫瘤的血管生成，進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［30］。此外，研究發(fā)現(xiàn)在顱內(nèi)腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）中，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞m6A 修飾主要分布在新生血管周圍，并與血管周圍病理生態(tài)協(xié)同作用，介導(dǎo)TIME 的免疫抑制表型，同時，聚類分析顯示，m6A 與血管生成對免疫抑制有協(xié)同促進(jìn)作用［31］。血管生成是膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展以及增殖的關(guān)鍵，m6A 修飾和血管生成之間的協(xié)同效應(yīng)，為膠質(zhì)瘤的血管靶向治療帶來新的方向。

3 m6A 修飾在膠質(zhì)瘤中的應(yīng)用

m6A 修飾不僅在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中起到不同的生物學(xué)作用，而且在膠質(zhì)瘤的臨床治療上中扮演著重要角色，其在膠質(zhì)瘤的診療、預(yù)后評估等方面都有不俗的表現(xiàn)。

3.1 m6A 修飾參與膠質(zhì)瘤的診斷近些年來，隨著表觀遺傳學(xué)的研究，m6A 修飾被認(rèn)為是診斷GBM 有效的生物標(biāo)志物，一些表觀遺傳狀態(tài)確實解釋了GBM 的結(jié)果。多項組學(xué)研究［32］表明，炎癥水平較高、腸道微生物多樣性減少的患者血清中FTO 水平顯著降低。另一項研究［33］發(fā)現(xiàn)，外周血RNA 中的m6A 是胃腺癌的潛在診斷生物標(biāo)志物。YTHDF1 作為m6A 結(jié)合蛋白，能加速m6A修飾的mRNAs 在細(xì)胞質(zhì)中的翻譯，在多種人類癌癥中高度表達(dá)，被證實與癌癥預(yù)后不良密切相關(guān)，也可作為臨床診斷和治療的分子標(biāo)志物［34］。因此，對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤來說，從外周血或腦脊液中鑒定m6A 修飾可能是診斷GBM 的一種有前途的方法。

3.2 m6A 修飾參與膠質(zhì)瘤的治療當(dāng)前臨床上對于膠質(zhì)瘤多采用手術(shù)聯(lián)合放化療、電場治療等綜合療法，但其具有很強的侵襲、轉(zhuǎn)移特性，且很難從腦中完全切除，復(fù)發(fā)是難免的。研究表明將m6A 修飾作為靶點進(jìn)行基因治療能有效地抑制膠質(zhì)瘤的惡性行為，從而達(dá)到治療目的。FTO 的轉(zhuǎn)錄活性可被轉(zhuǎn)錄因子SPI1 抑制，而SPI1 的轉(zhuǎn)錄活性可被SPI1 抑制劑DB2313 特異性阻斷，用該抑制劑治療可恢復(fù)內(nèi)源性FTO 的表達(dá)，降低GBM 的腫瘤負(fù)荷，提示FTO 可作為GBM 一種新的治療分子靶點［27］。TANG等［35］發(fā)現(xiàn)ALKBH5基因的缺失顯著抑制膠質(zhì)瘤移植瘤的生長，挽救抗腫瘤免疫反應(yīng)，增加腦脊液中細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子，同時顯著抑制了程序性細(xì)胞死亡配體1（PD-L1）蛋白的表達(dá)。此外，RNA 免疫沉淀測序和RNA 測序證實ZDDHC3 是ALKBH5 的直接靶標(biāo)，ALKBH5缺失會損害YTHDF2 介導(dǎo)的ZDHHC3mRNA 的穩(wěn)定性，從而通過加速PD-L1 在膠質(zhì)瘤中的降解。因此將m6A 修飾作為靶點治療，有望成為抑制膠質(zhì)瘤增殖、轉(zhuǎn)移、促進(jìn)其凋亡的新型方案，同時聯(lián)合放化療、電場治療有可能會有意想不到的效果。

3.3 m6A 修飾參與膠質(zhì)瘤的預(yù)后評估分子靶向治療與腫瘤電場治療以及放化療聯(lián)合應(yīng)用，可以改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后［3］，近年來發(fā)現(xiàn)m6A 修飾在膠質(zhì)瘤的預(yù)后評估中發(fā)揮重要作用。研究［27］表明FTO 的表達(dá)與GBM 的惡性程度有關(guān)，但與MGMT 啟動子甲基化、年齡或性別無明顯相關(guān)性，Kaplan-Meier 生存分析顯示，F(xiàn)TO 低表達(dá)的GBM 患者預(yù)后較差，生存期短于FTO 高表達(dá)者，提示FTO可作為GBM 患者的一個潛在的預(yù)后指標(biāo)。另一項研究［36］發(fā)現(xiàn)ALKBH5 的mRNA 和蛋白在膠質(zhì)瘤中表達(dá)上調(diào)，且ALKBH5 的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的分級、亞型和腫瘤類型有關(guān)，COX 回歸分析顯示ALKBH5是膠質(zhì)瘤患者的獨立預(yù)后因素，同時，ALKBH5 高表達(dá)的患者總生存期明顯短于ALKBH5 低表達(dá)的患者。m6A 修飾異常表達(dá)的水平可能與膠質(zhì)瘤的惡性程度、分級、亞型有關(guān)，可以作為臨床上指導(dǎo)診治的參考指標(biāo)，但其可靠性及靈敏度有待進(jìn)一步提升。

4 總結(jié)與展望

膠質(zhì)瘤是嚴(yán)重危害患者身心健康的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，盡管手術(shù)輔助放化療、電場治療在今天經(jīng)常被使用，但大多數(shù)患者的預(yù)后仍然很差。因此，急切需要找到新的診療方法。近些年來，在RNA 表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域?qū)6A 修飾的研究描繪出一幅m6A 甲基化受編寫者和擦除者的調(diào)控，并通過讀取者一起參與RNA 新陳代謝的全面圖景。甲基化過低或過高都有可能導(dǎo)致基因的異常表達(dá)，從而在疾病中發(fā)揮不同的作用。m6A 修飾不僅在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中起到不同的生物學(xué)作用，而且在膠質(zhì)瘤的診療、預(yù)后評估等方面都有著不俗的表現(xiàn)。但當(dāng)前階段，我們對于m6A 修飾的研究還不夠深入，還不能闡明m6A 調(diào)控基因表達(dá)的基本機制、不清楚m6A 作為調(diào)控系統(tǒng)的本質(zhì)，以及m6A沉積與其他細(xì)胞過程相互的作用。相信隨著我們不斷的研究，作為表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的一顆冉冉升起的新星，m6A 修飾有望在膠質(zhì)瘤的治療中得到廣泛應(yīng)用。