運動促SCFA生成調(diào)控Wnt信號通路增加骨形成的研究

鐘 麗，陶小平，張志斌

（廣州工商學(xué)院，廣東 廣州 510800）

骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，OP）是一種以機(jī)體骨量減少、骨小梁數(shù)量減少、變細(xì)、斷裂，同時骨皮質(zhì)變薄、孔數(shù)增多為主要特征的衰老表現(xiàn)，與骨脆性增加、骨折風(fēng)險增高密切相關(guān)，是臨床中骨科的多發(fā)病之一［1-2］。我國60歲以上人群中OP發(fā)病率可達(dá)50%以上，50歲以上的女性中，約25%患有OP，同時由OP而引起髖關(guān)節(jié)骨折的男性約為40%［3］。骨主要承擔(dān)支撐身體、保護(hù)內(nèi)臟器官的作用，同時參與Ca代謝。在機(jī)體的全生命周期中，骨組織受內(nèi)環(huán)境及遺傳、運動、生活方式等外界因素的影響，呈動態(tài)變化［4］。一方面，破骨細(xì)胞持續(xù)吸收骨，同時成骨細(xì)胞持續(xù)生成骨，維持動態(tài)平衡。人體的骨量在生長期時逐漸增加，在25歲成熟期時達(dá)到峰值，此后隨年齡的增加而逐漸降低。研究表明，運動產(chǎn)生的力學(xué)刺激可以有效調(diào)節(jié)骨發(fā)育，對骨生長和骨形狀、強(qiáng)度等解剖學(xué)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，進(jìn)而預(yù)防的OP發(fā)生［5］。 目前研究已知，Wnt通路、Notch通路、MAPK通路及Hedgehog通路是調(diào)節(jié)骨代謝的主要通路［6-7］，其中Wnt通路起主導(dǎo)作用，可通過減少細(xì)胞凋亡、促進(jìn)骨細(xì)胞生成進(jìn)而促進(jìn)骨結(jié)構(gòu)恢復(fù)，增加骨量。而研究證實，短鏈脂肪酸（Short Chain Fat Acid，SCFA）對OP可起到較好的防止作用，且運動可影響SCFA的表達(dá)，此外SCFA的表達(dá)與Wnt通路的激活有關(guān)。基于此背景，本研究通過給予OP大鼠運動干預(yù)，探究運動對SCFA及Wnt通路的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物與主要儀器、試劑

1）實驗動物：選取SPF級雌性SD大鼠共45只，體重200±20g，購于中國科學(xué)院上海實驗動物中心，許可證號SCXK（滬）2008-0016。 每籠5只，常規(guī)喂養(yǎng)。 室溫（20±1）℃，遵循12h/12h晝夜交替，室內(nèi)保持通風(fēng)良好，自由進(jìn)食進(jìn)水。

2）主要實驗儀器：雙能X線骨密度儀器 （GE Lunar Prodigy，美國）；全自動組織脫水機(jī)（櫻花公司，日本）；組織包埋機(jī)（美康EC-350，德國）；電子萬能試驗機(jī)（INSTRON，美國）；熒光攝像系統(tǒng)（Leica，德國）；冷凍離心機(jī)（Eppendorf，德國）；

3）主要試劑：3%戊巴比妥鈉；定量試劑盒 （大連TAKARA，中國）；PCR引物（上海生工，中國）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連TAKARA，中國）。

1.2 動物分組與造模

將45只雌性SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法，隨機(jī)分為對照組、假手術(shù)組與實驗組，每組各15只。對照組與實驗組采用去卵巢法建立骨質(zhì)疏松模型。將大鼠依照35mg/kg劑量注射戊巴比妥麻醉后，從腹正中線暴露腹腔，結(jié)扎雙側(cè)卵巢后依次縫合肌肉和皮膚。假手術(shù)組在打開腹腔后，僅切術(shù)卵巢周圍部分脂肪組織，隨后縫合皮膚。各組大鼠在造模后，于臀肌處注射慶大霉素（0.01ml/kg），連續(xù)注射3天。

1.3 干預(yù)方法

對照組大鼠與假手術(shù)組大鼠僅進(jìn)行常規(guī)喂養(yǎng)，無運動干預(yù)。

實驗組大鼠進(jìn)行跑臺運動干預(yù)：跑臺設(shè)定速度為0.8km/h，坡度為0°，每次訓(xùn)練30min，每周訓(xùn)練5天，共進(jìn)行12周訓(xùn)練。

1.4 實驗指標(biāo)

1.4.1 大鼠一般情況比較

造模后1d，觀察記錄各組大鼠的精神狀態(tài)、活動狀態(tài)、毛發(fā)光澤度、飲水、睡眠、排便排尿情況。

1.4.2 骨密度測定

參考文獻(xiàn)的方法以L2作為骨密度和骨組織形態(tài)學(xué)的研究對象。

將大鼠麻醉后（7%水合氯醛，腹腔注射0.5ml/100g），斷頭處死。取出大鼠L2椎體和右側(cè)股骨，將軟組織清理干凈后，采用骨密度測量儀測定其骨密度。

1.4.3 骨組織形態(tài)學(xué)觀察

取大鼠L2椎體，軟組織清除干凈后，選用4%多聚甲醛液固定48h，隨后用14%EDTA液脫鈣處理2周，并進(jìn)行脫水、透明、包埋、切片，制成3～4μm石蠟切面，HE染色處理后于鏡下觀察骨組織形態(tài)學(xué)變化。

1.4.4 骨生物力學(xué)測定

L2椎體骨密度測定完畢后，將棘突、橫圖、軟骨終板、椎板等修剪后，放置于試驗機(jī)上進(jìn)行椎體壓縮實驗，壓縮速率為6mm/min，記錄各組大鼠的彈性模量和最大載荷。

1.4.5 相關(guān)mRNA水平

將大鼠左側(cè)股骨軟組織清楚后，使用DEPC浸泡的錫箔紙包裹，放入液氮中凍存。檢測時，將樣本從液氮中取出并制成粉末，向樣本中加入TRIzol300μl混勻，靜置5min。隨后加入氯仿0.2ml，混勻后靜置3min。選用高速離心機(jī)將樣本以4℃、5 000r/min離心20min，將上層水液取至另一離心管內(nèi)，加入0.5ml異丙醇后混勻靜置10min，隨后以4℃、5 000r/min離心10min，棄掉上層清液，向樣本內(nèi)加入75%乙醇1ml，洗滌后以4℃、5 000r/min離心5min，棄去上層清液，室溫下干燥約10min后加入DEPC水20μl溶解。將99μlDEPC加入至1μl樣品中，測定總RNA樣品的濃度和純度。

依照試劑盒說明書，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：加入2μl第一鏈反應(yīng)緩沖液、0.5μl逆轉(zhuǎn)錄酶、總RNA 2μl、Oligo dT引物0.5μl，隨后加入DEPC水補(bǔ)齊至10μl，混勻后靜置20min。隨后85℃加熱15s，與冰水中靜置備用。參考試劑盒操作說明 （大連TAKARA）開始PCR反應(yīng)：按照94℃5min—94℃15s—60℃50s次序，循環(huán)擴(kuò)增共40次。將β-actin作為內(nèi)參，對目的基因進(jìn)行定量。在60℃條件下檢測熒光值進(jìn)而得出CT值，并計算相對定量。引物基因序列詳見表1。

表1 引物基因序列

1.4.6 SCFA含量測定

收集各組大鼠干預(yù)前后的糞便備用。取0.2g樣品置于離心管內(nèi)，加入0.5ml純水溶解后，旋渦1min后以10 000r/min離心5min，過濾后移入2ml離心管內(nèi)備用。向離心管內(nèi)加入50μl 50%的H2SO4溶液，再加入750μl內(nèi)標(biāo)溶液，旋渦1min后以10 000r/min離心5min，置于4℃冰箱內(nèi)冷卻30min，隨后選用氣相色譜分析法樣品中乙酸、丙酸、丁酸含量。選用16S rDNA法對SCFA含量進(jìn)行測序分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

選用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料選用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較選用單因素方差分析，兩兩組間比較采用LSD-t檢驗。以p＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較

各組大鼠在造模后均無死亡。對照組大鼠出現(xiàn)進(jìn)食減少、活動減少、毛色失去光澤等表現(xiàn)。假手術(shù)組大鼠進(jìn)食、活動及皮毛光澤無異常表現(xiàn)。實驗組大鼠的進(jìn)食、活動較對照組有所改善，毛發(fā)光澤有所恢復(fù)。

2.2 各組大鼠骨密度比較

結(jié)果表明，與假手術(shù)組大鼠相比，對照組大鼠的L2椎體和股骨的骨密度明顯降低，同時實驗組大鼠的L2椎體密度和股骨的骨密度較對照組大鼠明顯提高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。 詳見表2。

表2 各組大鼠骨密度比較（g/cm2，）

表2 各組大鼠骨密度比較（g/cm2，）

注：與假手術(shù)組相比，*p＜0.05；與對照組相比，#p＜0.05；下表同

組別 n假手術(shù)組150.165±0.014股骨骨密度 L2椎體0.178±對照組實驗組15 15 0.126±0.009*0.142±0.010#骨密度0.019 0.145±0.016*0.160±0.017#

2.3 各組大鼠骨組織形態(tài)學(xué)比較

結(jié)果表明，對照組小鼠可見骨小梁數(shù)目下降，同時骨小梁變薄變細(xì)且排列紊亂欠規(guī)則，同時骨髓腔擴(kuò)大伴有微骨折等。假手術(shù)組大鼠骨小梁排列整齊規(guī)則，無間隙增大的情況。實驗組大鼠的骨小梁排列尚為規(guī)則整齊，骨小梁有所變細(xì)，且部分區(qū)域的骨小梁間隙稍微大。

2.4 各組大鼠骨生物力學(xué)比較

結(jié)果表明，與假手術(shù)組大鼠相比，對照組大鼠的L2椎體彈性模量及最大載荷明顯降低，同時與對照組大鼠相比，實驗組大鼠的L2椎體彈性模量及最大載荷明顯提高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。 詳見表3。

表3 各組大鼠生物力學(xué)指標(biāo)比較（）

表3 各組大鼠生物力學(xué)指標(biāo)比較（）

組別 n假手術(shù)組對照組實驗組15 15 15 802.52±209.20 593.13±136.03*750.41±170.31#彈性模量（GPa） 最大載荷（N）192.12±57.05 132.81±41.02*179.18±51.60#

2.5 各組大鼠mRNA表達(dá)比較

結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，對照組大鼠股骨的βcatenin、Lrp-5、Osx、Runx2 mRNA的表達(dá)明顯下降， 而與對照組相比，實驗組大鼠的 β-catenin、Lrp-5、Osx、Runx2 mRNA的表達(dá)明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。詳見表4。

表4 各組大鼠mRNA表達(dá)比較（）

表4 各組大鼠mRNA表達(dá)比較（）

組別 n假手術(shù)組對照組實驗組15 15 15 1.20±0.18 0.87±0.16 1.22±0.21 β-catenin Lrp-5 2.17±0.40 1.80±0.33 2.12±0.37 Osx 1.15±0.17 0.93±0.09*1.13±0.16#Runx2 1.41±0.15 0.98±0.07*1.36±0.09#

2.6 各組大鼠治療前后SCFA含量比較

干預(yù)前，與假手術(shù)組相比，對照組、實驗組大鼠的乙酸、丙酸、丁酸含量均下降，干預(yù)后，實驗組大鼠的SCFA含量均較干預(yù)前升高，明顯高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義 （p＜0.05）。 詳見表5。

表5 各組大鼠干預(yù)前后SCFA含量比較（mmol/l，）

表5 各組大鼠干預(yù)前后SCFA含量比較（mmol/l，）

短鏈脂肪酸組別 n乙酸 丙酸 丁酸假手術(shù)組15對照組15實驗組15干預(yù)前干預(yù)后干預(yù)前干預(yù)后干預(yù)前干預(yù)后0.68±0.19 0.63±0.13 0.47±0.14*0.33±0.13*0.46±0.15*0.41±0.13#0.26±0.07 0.27±0.06 0.15±0.04*0.14±0.05*0.16±0.05*0.19±0.05#0.25±0.07 0.26±0.06 0.14±0.04*0.13±0.04*0.14±0.05*0.19±0.05#

3 討論

OP是臨床中常見的骨科疾病，以機(jī)體的骨結(jié)構(gòu)退化伴有單位體積內(nèi)骨量下降及骨脆性增加為主要特征，易引起肌力下降、疼痛以及骨折等并發(fā)癥［8］。本研究中，對照組大鼠出現(xiàn)明顯的飲食不加、毛發(fā)光澤下降等改變，而實驗組大鼠上述癥狀較輕，提示運動可改善OP導(dǎo)致的飲食減退、活動減少等并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險。考慮這可能與運動改善了大鼠骨質(zhì)疏松病情進(jìn)而提高肌力和緩解疼痛有關(guān)。早期OP起病較為隱匿，隨著病情進(jìn)展可出現(xiàn)壓縮骨折、脊柱變形等形態(tài)改變，嚴(yán)重影響患者的日常生活［9］。OP的發(fā)生與機(jī)體的遺傳因素、內(nèi)分泌水平、營養(yǎng)水平、免疫因素及生活方式等密切相關(guān)。機(jī)體的破骨-成骨是一動態(tài)平衡過程，針對這一過程，臨床中常采用加強(qiáng)抗骨吸收、促進(jìn)骨形成等藥物治療，前者包括降鈣素、雌激素替代療法、選擇性雌激素受體拮抗劑等，后者常選用甲狀旁腺素、胰島素樣生長因子及氟化物等［10］。絕經(jīng)后OP是原發(fā)性O(shè)P的一種證型。雌激素在調(diào)控骨骼系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，當(dāng)女性絕經(jīng)后，卵巢功能逐漸衰退，進(jìn)而導(dǎo)致骨代謝改變［11］。本研究中，選用模擬絕經(jīng)后的OP模型開展研究。HE染色結(jié)果示造模后大鼠出現(xiàn)明顯的OP病理改變，提示造模成功。

同時本研究中HE染色結(jié)果顯示，對照組大鼠出現(xiàn)骨小梁排列紊亂、數(shù)目下降、骨小梁變薄及骨髓腔增大伴少量微骨折等OP病理性表現(xiàn)，實驗組大鼠上述病理改變有所減輕，骨小梁排列尚整齊規(guī)則，間隙略有增加，提示運動能有效的減緩OP進(jìn)程，改善骨組織形態(tài)。骨密度是OP的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一，能夠有效的預(yù)測骨折風(fēng)險，也是評價治療效果的參考［12］。雙能X線骨密度測定是一種廣泛認(rèn)可的定量分析方法。結(jié)果表明，實驗組大鼠的骨密度明顯高于對照組，提示運動能有效的改善OP大鼠的骨質(zhì)疏松狀態(tài)，延緩OP大鼠的骨密度下降。OP患者的骨折發(fā)生風(fēng)險較普通人高，骨強(qiáng)度的下降與脆性骨折的發(fā)生關(guān)系密切，骨強(qiáng)度可有效反饋機(jī)體抗骨折的能力［13-14］。本研究中選用生物力學(xué)測試比較各組大鼠的骨強(qiáng)度，結(jié)果表明，實驗組大鼠的彈性模量與最大載荷均明顯高于對照組，提示運動能有效改善OP大鼠的骨強(qiáng)度，改善其骨生物力學(xué)參數(shù)，提高抗骨折能力。

Wnt/β-catenin通路是調(diào)控骨代謝的重要通路，在調(diào)節(jié)骨發(fā)育、形成、吸收重建中發(fā)揮重要作用［15］。β-catenin是Wnt通路的關(guān)鍵分子，在成骨細(xì)胞分化以及功能形成中發(fā)揮重要作用。Lrp-5是Wnt蛋白輔助受體之一，在骨量積累過程中發(fā)揮重要作用。Runx2是成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通過上調(diào)軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中相關(guān)礦化蛋白基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而促進(jìn)新骨形成［16］。Osx是成骨細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子之一，在骨形成和成骨細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用，是經(jīng)典Wnt/βcatenin通路的下游基因［17］。當(dāng)Wnt識別到輔助受體脂蛋白受體相關(guān)蛋白 （Lipoprotein Receptor Related Protein5/6，LRP5/6）后，促進(jìn)β-catenin向核內(nèi)遷移并與轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物結(jié)合，隨后激活Runx2并促進(jìn)下游基因表達(dá)［18］。本研究結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，對照組大鼠股骨的 β-catenin、Lrp-5、Osx、Runx2 mRNA的表達(dá)明顯下降，而與對照組相比，實驗組大鼠的βcatenin、Lrp-5、Osx、Runx2 mRNA的表達(dá)明顯升高， 提示運動可能通過激活Wnt/β-catenin通路進(jìn)而發(fā)揮緩解OP相關(guān)癥狀、改善OP表現(xiàn)的作用。

SCFA是由腸道有益菌產(chǎn)生的代謝物，既往研究表明，SCFA對OP有較好的防治作用，可以通過抑制破骨細(xì)胞分化、促進(jìn)成骨等途徑進(jìn)而改善OP相關(guān)癥狀。Xie等［19］研究結(jié)果顯示，SCFA的表達(dá)可靶向調(diào)控Wnt/β-catenin的表達(dá)。Tindaro［20］等最新一項研究證實，運動可通過調(diào)控SCFA的表達(dá)進(jìn)而運動員免疫力和能量代謝過程。本研究結(jié)果表明，干預(yù)前，與假手術(shù)組相比，對照組、實驗組大鼠的乙酸、丙酸、丁酸含量均下降，干預(yù)后，實驗組大鼠的乙酸、丙酸、丁酸含量均較干預(yù)前升高，明顯高于對照組，提示運動能夠有效提高OP大鼠的SCFA含量，進(jìn)而發(fā)揮改善OP的作用。而運動干預(yù)后SCFA含量的增加與Wnt通路的簽在關(guān)聯(lián)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上，運動可能通過上調(diào)SCFA含量、激活Wnt/β-catenin通路改善大鼠的骨密度度、骨生物力學(xué)參數(shù)和骨組織形態(tài)，繼而改善OP相關(guān)癥狀。