機械損傷構建大鼠宮腔粘連模型效果分析

嚴子璇，艾 瑛，陳明慶，閆雪蘭，劉 嘉

（1.昆明理工大學醫學院，云南 昆明 650032；2.云南省第一人民醫院/昆明理工大學附屬醫院婦產科，云南 昆明 650032)

宮腔粘連也稱子宮內粘連（intrauterine adhesions，IUA），是一種主要由于宮腔內操作，如人工流產、診斷性刮宮術、宮腔鏡下息肉摘除及肌瘤剔除、手取胎盤等，導致子宮內膜受損后纖維化及異常修復、子宮壁粘連、宮腔容積縮小的常見婦科疾病[1，2]。該疾病以月經量減少或閉經、下腹痛、不孕、習慣性流產及早產、胎盤位置異常等產科并發癥為主要臨床表現[3，4]。近年來，由于人工流產和宮腔鏡手術等宮腔操作的增多，加重子宮內膜損傷及子宮內膜感染，使IUA 患病率逐漸提高[5]，已成為一種常見的婦科疾病。盡管我國制定了適合國情的分類體系，臨床醫生可根據評分標準及臨床經驗采取不同的治療方法，但IUA 的治愈率仍低下，治療后復發率高，對患者的生育功能、生殖健康及生活質量產生了嚴重影響[6]。目前對于IUA 發病機制、病程進展及臨床防治仍然需要進一步探索。合適的動物模型能為研究IUA 發病機制及預防、治療策略提供助力。而由于IUA 的形成機制尚不明確，建模方法也尚未統一，造模后也沒有固定的評價標準，因此探索穩定的IUA動物模型構建方法及合適的建模時間十分有必要。本研究旨在探索機械損傷構建大鼠宮腔粘連模型的效果與評價，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雌性未受孕8 周齡SD 大鼠20 只，體質量280 g 左右，購自成都達碩實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（川）2014-028。室溫（23±2）℃，濕度45%～55%條件下飼養，每日光照時間12 h，自由攝水進食，適應性飼養1 周。該研究符合動物福利和倫理原則、符合國家關于實驗動物福利倫理相關規定。

1.2 建模方法 通過陰道涂片方法區分不同動情周期大鼠，取動情后期或間期的雌性未受孕SD 大鼠。采用異氟烷麻醉機進行麻醉，5%異氟烷誘導麻醉，2%異氟烷術中持續麻醉。手術過程嚴格無菌操作。大鼠腹部備皮，碘伏消毒，于陰道口上3～4 cm 處在皮膚正中線上作2～3 cm 的縱形切口，暴露肌肉，于肌肉腹白線作2～3 cm 的縱形切口，暴露腹腔；用纏有膠帶的鑷子將右側子宮牽拉出腹腔，于卵巢下0.5 cm 處剪口，置入微型刮宮器，刮出內膜組織后縫合宮體，卵巢端結扎（刮宮組）。左側子宮同法牽拉出腹腔后剪口暴露內膜，不做刮宮操作，卵巢端結扎，最后將雙側子宮恢復至正常位置，可吸收縫合線縫合切口，縫合處滴慶大霉素0.2 ml（2 ml∶80 萬單位）（對照組）。術后第2 天，肌肉注射10 倍稀釋后的慶大霉素0.2 ml（2 ml∶80 萬單位），連續給藥3 d。

1.3 評估標準與方法

1.3.1 機械損傷法建模效果的評估 10 只大鼠通過上述方法建模，10 只對照組大鼠僅切開暴露內膜，未進行刮宮操作，兩組通過大體標本觀察宮腔形態；常規固定后HE 染色、Masson 染色并觀察組織形態；HE 染色下于低倍鏡下（×5）測量子宮內膜厚度，每組隨機選取3 張切片，每張切片從不同角度測量5次，取平均值作為結果；低倍鏡下（×20）計數子宮內膜腺體數目，每張切片隨機選取5 個視野作為結果，取平均值作為結果；Masson 染色下與高倍鏡下（×200）計算子宮內膜纖維化面積比率（子宮內膜間質纖維化面積除以子宮內膜間質及腺體總面積），每組隨機選取3 張切片，每張切片隨機選取5 個視野，取平均值作為結果。

1.3.2 IUA 建模后不同時間宮腔粘連情況 于構建大鼠宮腔粘連模型后第3、5、7、9 天各處死2 只大鼠，觀察造模后宮腔形態，收集子宮受損端組織，提取蛋白用于Western Blot 檢測TGF-β1的表達。

1.4 統計學方法 采用SPSS 26.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料以（）表示，采用t檢驗。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模后標本的外觀比較 對照組大鼠宮腔表面光滑呈粉紅，刮宮組大鼠子宮直徑與對照組相比明顯增粗，宮腔表面可見環形狹窄，宮腔失去正常形態，局部或整體粘連阻塞，部分子宮遠端可見積水樣改變，子宮內膜與對照組相比蒼白，并有類似纖維化樣的改變。

2.2 造模后標本的組織學比較 正常大鼠子宮宮腔形態規則，分為內膜層、肌層、漿膜層3 層，內膜層襯于宮腔表面，由單層柱狀上皮覆蓋，間質內可見腺體排列，組織間可見血管和成纖維細胞，巨噬細胞和漿細胞散布其中。從子宮組織學差異分析，對照組肌層完整，內膜豐厚，腺體豐富；刮宮組宮腔粘連側子宮可見宮腔狹窄甚至閉塞，子宮內膜變薄甚至消失，間質內炎癥細胞浸潤，可見大量膠原纖維混亂排列，腺體減少甚至消失。若刮宮組子宮損傷過度，可見子宮失去正常結構，內膜及肌層徹底壞死。兩組子宮HE染色結果見圖1、圖2。

圖1 對照組子宮HE 染色（×10）

圖2 刮宮組子宮HE 染色（×10）

2.3 兩組子宮內膜指標比較 刮宮組子宮內膜厚度薄于對照組、子宮內膜腺體數量少于對照組、子宮內膜纖維化面積比率高于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 兩組子宮內膜指標比較（）

表1 兩組子宮內膜指標比較（）

2.4 IUA 建模后不同時間宮腔粘連情況分析 子宮建模部位在第3 天宮腔粘連程度最高，可見組織充血，宮腔中、重度水腫粘連，第5 天宮腔輕度水腫粘連，第7、9 天宮腔粘連、水腫程度逐漸減輕，即建模后宮腔粘連在第3 天到達高峰，第5 天后開始修復。

2.5 刮宮后不同時間點受損子宮TGF-β1的表達Western Blot 檢測結果顯示，與其他時間點相比，刮宮后第3 天受損子宮TGF-β1的表達量最高，見圖3。

圖3 刮宮后不同時間點受損子宮TGF-β1 的表達

3 討論

目前研究者主要采用大鼠、小鼠、小型犬、新西蘭兔以及部分靈長類動物構建宮腔粘連模型。其中，靈長類動物（如恒河猴、狒狒等）雖然在月經周期、生殖解剖生理及基因序列上與人類相似，但由于其成本高、操作復雜，難以廣泛使用[7]。相對而言，大鼠、小鼠以及兔、小型犬等物種遺傳背景清晰、成本低、實驗操作簡單可控，成為研究者構建宮腔粘連模型，研究子宮損傷修復的理想動物。大鼠具有實驗操作簡便、結果直觀迅速、飼養和實驗成本低廉等眾多優勢，且大鼠繁殖力強、妊娠周期短，可大大縮短實驗周期，另其雙角子宮可構建自身對照，降低實驗偏倚。因此，本研究選擇以大鼠構建宮腔粘連動物模型。此外，本研究以機械損傷（刮宮法）為建模方法，構建大鼠宮腔粘連模型，因動物來源易于獲取、操作過程便于控制等優點，且該模型的發病機制、子宮內膜形態、組織學改變均類似于人類宮腔粘連，可為研究IUA 的發病機理、預防、治療等提供基礎。

對于宮腔粘連模型的構建方法，目前主要包括物理性損傷（冷凍損傷、熱損傷、宮腔放置銅線或含成纖維細胞的聚乙烯海綿等）、化學性損傷（25%甲醛、2%福爾馬林乙醇溶液、硫酸銅無水片劑、苯酚膠漿、氟化物和乙醇等）、機械性損傷（利用手術器械，刮除子宮內膜）、雙重病理損傷模型（機械和降低雌激素聯合法、機械和感染雙重損傷法、雙重機械損傷法等）、多重損傷法等[8，9]。對于不同的建模方法，有研究認為[10]，單一處理方法損傷的子宮內膜容易恢復，無法構建長期有效的宮腔粘連模型，且與人類IUA 多因素影響的形成機制不符，故多采用雙重或多重損傷方法。但臨床多數宮腔粘連繼發于子宮創傷，刮宮術是常見的損傷因素，對于不完全流產、胎盤殘留而反復刮宮者更易發生宮腔粘連，其中25%見于產后1～4 周的刮宮術，且其手術次數與IUA 發生呈正比[11]。此外，刮宮術等宮腔操作后導致的子宮內膜纖維化、炎癥反應、細胞外基質過度沉積等一系列病理生理變化是人類宮腔粘連發生的主要病因，故本研究采用單一機械損傷法構建大鼠宮腔粘連模型，并探討單一機械損傷對于構建大鼠宮腔模型的效果。

目前評判是否成功建造宮腔粘連動物模型沒有統一的標準，認為可以通過內膜厚度、子宮內膜纖維面積比率及腺體數目的變化評價造模效果[12]。本研究結果顯示，子宮建模部位在第3 天宮腔粘連程度最高，可見組織充血，宮腔中、重度水腫粘連，第5 天宮腔輕度水腫粘連，第7、9 天宮腔粘連、水腫程度逐漸減輕，即建模后宮腔粘連在第3 天到達高峰，第5天后開始修復；刮宮組子宮內膜厚度薄于對照組、子宮內膜腺體數量少于對照組、子宮內膜纖維化面積比率高于對照組（P＜0.05），提示構建的大鼠宮腔粘連模型其子宮內膜內膜變薄、子宮內膜腺體數量減少、子宮內膜纖維化面積比率增高，驗證了造模的成功。另外，創傷后的子宮內膜在修復過程中可發生炎癥期、組織形成期、組織重建期3 個病理生理變化時期，由大量的細胞、細胞因子及細胞外基質共同參與。成纖維細胞被激活并大量增殖，引起細胞外基質合成降解失衡、沉積增多，從而引起纖維組織形成[13]。TGF-β 是一類多功能的細胞因子，在成纖維細胞合成細胞外基質，進而導致膠原沉積，并在纖維組織形成的過程中起促進作用，被認為是參與纖維化形成的主要細胞因子[14]。本研究通過分析宮腔鏡粘連分離術后創面滲出液中粘連相關細胞因子濃度，發現與其他時間點相比，刮宮后第3 天受損子宮TGF-β1的表達量最高，提示刮宮后第3 天大鼠子宮宮腔粘連程度最為嚴重，第5 天開始修復，若進行藥物防治宮腔粘連的研究，可在術后給藥第3 天檢測宮腔粘連恢復情況，判斷藥物療效。Guo LP 等[15]研究發現，IUA 大鼠模型子宮內膜組織中TGF-β1的表達高于正常大鼠子宮內膜組織，認為TGF-β1高表達與IUA 的發展有關。也有研究發現[16]，TGF-β1表達水平與宮腔粘連程度呈正比。以上研究結果提示，在IUA 疾病進展中，TGF-β1發揮重要作用，并可反映宮腔粘連程度。

綜上所述，大鼠宮腔粘連模型可以通過機械刮宮構建，模型建立后子宮內膜變薄、子宮內膜腺體數量減少、子宮內膜纖維化面積增加，與人類宮腔粘連病理情況相似，且建模后第3 天，受損子宮TGF-β1的表達量最高，大鼠子宮宮腔粘連程度最為嚴重。