miR-200c 對顱咽管瘤侵襲性的影響及作用機制

張道寶，徐建國

（1.四川大學華西醫院神經外科，四川 成都 610000；2.樂山市人民醫院腦血管病科，四川 樂山 614000）

顱咽管瘤（craniopharyngioma，CP）是常見的中樞神經系統腫瘤，任何年齡均可發病，但其常見的發病年齡呈雙峰分布，主要有6～14 歲和50～70 歲2個高發年齡段，同時顱咽管瘤是兒童最常見的鞍區占位性病變。該病可分為2 種亞型，造釉細胞型顱咽管瘤（adamantinomatous craniopharyngioma，ACP）和鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤（papillary craniopharyngioma，PCP）。顱咽管瘤雖為良性腫瘤，但有著與惡性腫瘤相似的臨床特征。術后易復發是顱咽管瘤，特別是造釉細胞型顱咽管瘤的一個重要特點。microRNAs（miRNAs）是一類廣泛存在于動植物等真核生物中的非編碼RNA。microRNAs 的長度一般為21～23 個核苷酸，因不含有開放式閱讀框架，不能翻譯成蛋白質進行基因表達。他們通過堿基對互補的方式與靶基因結合，可以在轉錄和轉錄后水平調節靶基因表達。miRNA-200 家族在許多腫瘤的侵襲、轉移等環節起到了重要作用。據目前的文獻報道，在卵巢癌、乳腺癌、腦膜瘤等多種腫瘤中，miRNA-200家族的表達明顯低于其在正常組織中的表達。在一些腫瘤中，miRNA-200 家族的下調還預示患者的總體生存率降低及對化療反應不敏感[1]。2010 年四川大學華西醫院徐建國等[2]利用原代培養建立了能穩定傳代的顱咽管瘤細胞系，為開展顱咽管瘤的基礎研究提供了新的方法。本研究擬初步探討miRNA-200家族在顱咽管瘤中的作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 原代細胞培養所需標本來自2017 年6 月-2018 年12 月在四川大學華西醫院神經外科手術切除的無菌新鮮顱咽管瘤組織各5 例。

1.2 主要實驗材料 SYBR Green PCR 試劑盒（Ther mo，F-415XL），逆轉錄試劑盒（Thermo，#K1622），β -actin（abcam，ab8226），E -cadherin（abcam，ab1416），β-catenin（abcam，ab32572），HRP 標記山羊抗兔（武漢三鷹，SA00001-2），HRP 標記山羊抗小鼠（武漢三鷹，SA00001-1），Transwell（BD Biosciences，353097），SYBR Green PCR 試劑盒（Thermo，F-415XL），逆轉錄試劑盒（Thermo，#K1622）。

1.3 方法 PCP 組為正常培養的鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤原代細胞。ACP 組為正常培養的造釉細胞型顱咽管瘤原代細胞。

1.3.1 Q-PCR 檢測原代細胞的miRNA-200 家族各亞型表達 先行miRNA 的引物設計，再行RNA 提取，在細胞中加入0.25%胰蛋白酶1 ml 收集沉淀。分別加入相應量的Trizol 裂解液在沉淀細胞中裂解細胞，向離心管中加入預冷的氯仿（200 μl 氯仿/1 ml Trizol），離心機離心（4 ℃，12000 g）15 min；用20 μl DEPC 處理水溶解RNA，放在-20 ℃冰箱中保存待用。按照試劑盒操作說明書進行逆轉錄cDNA、PCR 擴增。

1.3.2 Transwell 檢測原代細胞的侵襲能力 先用0.25%胰酶消化收集，用離心機離心，PBS 液潤洗；用無血清的1640 培養基重懸細胞；預先將800 μl 含10% FBS 的DMEM 培養基（含雙抗）加入24 孔板中，將其放入Transwell 小室，等Matrigel 干成膠狀后，依次接入200 μl 各組細胞懸液在Transwell 上室。對于上室一側未遷移的細胞，用干凈的棉球將其擦干凈，然后用濃度為10%的甲醇溶液固定細胞30 min。小心切下膜，在膜上滴一滴5%結晶紫染液，室溫中放置20 min，PBS 清洗后顯微鏡下觀察拍照。

1.3.3 免疫熒光及WB 檢測原代細胞中β-catenin 和E-cadherin 的表達 第1 天：固定爬片15 min（4%的多聚甲醛），0.5%Triton X-100（PBS 配制）在室溫通透，時間控制在20 min 左右；在玻片上滴加正常山羊血清，室溫下封閉，時間約30 min；將足量稀釋好的一抗滴加在每張玻片上，將所有玻片放入濕盒，將溫度調至4 ℃，孵育過夜。第2 天：加熒光二抗：PBST 重復浸洗爬片，滴加稀釋好的熒光二抗，將玻片放入濕盒中，在20 ℃～37 ℃的溫度下孵育1 h，再次用PBST 浸洗切片。復染核：滴加DAPI 在黑暗處孵育，對標本進行染核；用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.3.4 造釉細胞型顱咽管瘤細胞檢測 通過對造釉細胞型顱咽管瘤原代培養細胞過表達和敲低miR-200c，研究miR-200c 對造釉細胞型顱咽管瘤侵襲性的影響及作用機制：A：造釉細胞型顱咽管瘤細胞+miRNA control；B：造釉細胞型顱咽管瘤細胞+miR-200c mimic；C：造釉細胞型顱咽管瘤細胞+miR-200c inhibitor。Q-PCR 檢測各組造釉細胞型顱咽管瘤細胞中的miRNA-200c 表達差異，Transwell檢測miR-200c 對造釉細胞型顱咽管瘤細胞侵襲能力的影響；免疫熒光及WB 檢測各組細胞E-cadherin和β-catenin 的表達，操作步驟同原代細胞檢測。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0 統計軟件進行數據分析，所有數據以（）表示，不同組間兩兩比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）中的LSD 法（最小顯著性法），P＜0.05 為差異有統計學意義，P＜0.01 表示統計學意義顯著，P＜0.001 表示統計學意義極顯著。

2 結果

2.1 miR-200 家族在顱咽管瘤原代培養細胞的表達情況

2.1.1 Q-PCR 檢測兩組原代細胞的miRNA-200 家族各亞型表達 與鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤原代細胞相比，造釉細胞型顱咽管瘤組中miRNA-200 家族表達呈整體下降趨勢，其中miRNA-200c 的下降最為明顯，統計學意義極顯著（P＜0.001），見圖1。

圖1 造釉細胞型顱咽管瘤及鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤原代細胞各亞型miRNA 的表達水平

2.1.2 Transwell 檢測兩組原代細胞的侵襲能力 結晶紫的染色結果可以看到造釉細胞型顱咽管瘤中穿過膜的細胞遠遠多于鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤的細胞，見圖2A、圖2B；造釉細胞型顱咽管瘤穿過膜的細胞遠遠多于鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤的細胞，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2C，說明造釉細胞型顱咽管瘤的細胞比鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤的細胞更有侵襲性。

圖2 Transwell 檢測ACP 和PCP 原代細胞的侵襲能力

2.1.3 免疫熒光檢測兩組原代細胞中β-catenin 的表達差異 以DAPI 染核進行定位。從Merge 的結果來看，β-catenin 在鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤中的表達主要在細胞膜上，而造釉細胞型顱咽管瘤中的表達主要在細胞核中，見圖3。

圖3 免疫熒光檢測ACP 和PCP 原代細胞β-catenin 的表達

2.1.4 免疫熒光檢測兩組原代細胞中E-cadherin 的表達 以DAPI 染核進行定位，從Merge 的結果來看，E-cadherin 在鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤中的表達高于造釉細胞型顱咽管瘤，見圖4。

圖4 免疫熒光檢測ACP 和PCP 原代細胞E-cadherin 的表達

2.1.5 WB 檢測兩組原代細胞中E-cadherin 和β-catenin 的表達 與鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤原代細胞相比，造釉細胞型顱咽管瘤的細胞中E-cadherin表達下調，而β-catenin 表達上調，見圖5。

圖5 WB 檢測ACP 和PCP 原代細胞E-cadherin和β-catenin 的表達

2.2 對造釉細胞型顱咽管瘤原代培養細胞過表達和敲低miR-200c 對其侵襲性的影響

2.2.1 Q-PCR 檢測各組造釉細胞型顱咽管瘤細胞中的miRNA-200c 表達差異 與對照組相比，經mimic，miRNA-200c 表達水平明顯升高（P＜0.01），而inhibitor干預后miRNA-200c 表達水平明顯下降（P＜0.01），見圖6。

圖6 各組miR-200c 表達情況

2.2.2 Transwell 檢測miR-200c 對造釉細胞型顱咽管瘤細胞侵襲能力的影響 與對照組相比，在miR-200c mimics 組，miR-200c 結晶紫染色細胞數量減少；而在miR-200c inhibitor 組，miR-200c 結晶紫染色細胞數量增加，見圖7A～圖7C。從細胞數量的統計結果來看，與對照組相比，miR-200cmimics組結晶紫染色細胞數量減少（P＜0.05），而miR-200c inhibitor 組結晶紫染色細胞數量增加（P＜0.05）。miR-200c inhibitor 組細胞數顯著多于miR-200c mimics 組（P＜0.01），見圖7D。

圖7 Transwell 檢測細胞侵襲性

2.2.3 免疫熒光檢測miR-200c 對造釉細胞型顱咽管瘤原代細胞中β-catenin 和E-cadherin 的表達影響過表達miR-200c 能促進E-cadherin 的表達，而抑制β-catenin 的表達；抑制miR-200c 的表達能抑制E-cadherin 的表達，促進β-catenin 的表達，見圖8。

圖8 免疫熒光檢測各組β-catenin 和E-cadherin 表達情況

2.2.4 Western blot 檢測各組細胞E-cadherin 和β-catenin 的表達差異 β-catenin 在miRNA-200C增高后表達下調，被抑制后又有恢復性表達，E-cadherin 則相反，見圖9。

圖9 Western blot 檢測各組β-catenin和E-cadherin 表達情況

3 討論

miRNA-200 家族共有5 個成員組成，根據其“種子序列”不同又可分為2 個亞族：miRNA-200c、miRNA -141 和 miRNA -200a、miRNA -200b 及miRNA-429，前者共同序列為AAUACU，后者為AACACU。兩者之間相差一個核苷酸（C 和U），因它們擁有不同的種子序列，所以具有不同的結合特異性，調節的靶基因也有細微的差別，但它們仍有許多共同的靶基因。miRNA-200c 是miRNA-200 家族中的一員，其編碼基因位于12 號染色體上。國內外學者們通過大量研究發現，miRNA-200c 在多種惡性腫瘤中的表達量與正常組織或者癌旁組織有明顯差異，目前已在乳腺癌[3]、卵巢癌[4-6]、肝癌[7，8]、腸癌[9]、膠質瘤[10]、胃癌[11]、肺癌[12]、胰腺癌[13]、膀胱癌[14]等惡性腫瘤中證實。

本課題通過原代細胞培養技術，分別培養出鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤及造釉細胞型顱咽管瘤的原代細胞，利用qRT-PCR 測定各組miRNA-200 家族的表達水平發現，與鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤相比，造釉細胞型顱咽管瘤組中miRNA-200 家族表達整體呈下降趨勢，其中miRNA-200c 的下降最為明顯，統計學意義極顯著（P＜0.001），因此可能是影響兩種不同類型顱咽管瘤侵襲差異的主要原因。

上皮間質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是上皮特性的細胞通過一系列的生物學轉變過程后，細胞極性和粘附性丟失或減弱，而細胞的遷移能力及細胞的侵襲性明顯增強[15，16]。EMT 是上皮性腫瘤發生遷移和侵襲的重要原因。EMT 的特征性改變包括：E-cadherin 表達降低，波形蛋白表達升高等。E-cadherin 是一種鈣依賴性的跨膜糖蛋白，它能介導同種細胞間相互粘合，主要分布于上皮細胞的表面，在維持上皮細胞表型、細胞骨架的穩定性、細胞極型、組織結構的完整性中有重要作用[17，18]。E-cadherin 表達下降是發生EMT 的關鍵一步。本實驗中Western blot 結果顯示，與鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤原代細胞相比，造釉細胞型顱咽管瘤的原代細胞中E-cadherin 表達下調。β-catenin 是一種多功能、高度保守的細胞骨架蛋白，由CTNNB1 編碼。β-catenin 可以存在細胞質、細胞膜和細胞核中，研究發現正常神經細胞中的β-catenin 存在于細胞膜中表達，而造釉細胞型顱咽管瘤中β-catenin 在細胞膜低表達，在細胞質及細胞核內過表達，并且這些細胞多位于實體瘤邊緣浸潤性較強的位置。本實驗通過免疫熒光檢測及Western blot 實驗顯示，與鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤原代細胞相比，造釉細胞型顱咽管瘤的細胞中β-catenin 表達上調，并進入細胞核。E-cadherin/β-catenin 復合物可使E-cadherin集中定位于細胞間的接觸部位，維持細胞的連接及細胞極性[19]。β-catenin 可與細胞膜上的E-cadherin結合形成復合物，從而增強細胞間的粘附作用。在造釉細胞型顱咽管瘤原代細胞中，β-catenin 主要分布在細胞質或者細胞核內，使E-cadherin/β-catenin 復合物的形成減少，進而導致細胞-細胞黏附減弱，促進腫瘤細胞向周圍組織侵襲性生長[20]。Transwell 實驗結果證實與鱗狀上皮乳頭型顱咽管瘤原代細胞相比，造釉細胞型顱咽管瘤的原代細胞具有更強的侵襲性。

本實驗通過mimic 過表達或inhibitor 抑制造釉細胞型顱咽管瘤原代細胞中miRNA-200c 的表達后發現，經mimic 干預后，miRNA-200c 表達水平明顯升高；而經inhibitor 干預后miRNA-200c 表達水平明顯下降，出現的表達情況符合預期，表明可以通過人為干預，過表達或抑制miRNA-200c 的表達，這為后續實驗奠定了基礎。EMT 使細胞間粘附降低，增加了細胞的運動性和播散能力。miRNA-200c 在腫瘤上皮間質轉化，進而促進腫瘤侵襲轉移過程中起到重要作用[21]。經免疫熒光檢測及Western blot 檢測發現，過表達miR-200c 后E-cadherin 的表達明顯增加，β-catenin 的表達明顯降低；而抑制miR-200c后E-cadherin 的表達明顯降低，β-catenin 的表達升高，且導致β-catenin 進入細胞核，β-catenin 入核后，E-cadherin/β-catenin 復合物將會相應減少。E-cadherin 或者β-catenin 的表達降低，均會影響E-cadherin/β-catenin 復合物的形成，使得細胞間的粘附作用降低，細胞極性消失，可能因此增加了細胞的侵襲性。從Transwell 的實驗結果來看，與對照組相比，miR-200c mimics 組結晶紫染色細胞數量減少，而miR-200cinhibitor 組結晶紫染色細胞數量增加，miR-200c inhibitor 組細胞數顯著多于miR-200c mimics 組，說明過表達miR-200c 后能夠抑制造釉細胞型顱咽管瘤細胞的侵襲性。

綜上所述，在造釉細胞型顱咽管瘤中，可能存在這樣一個通路，隨著造釉細胞型顱咽管瘤miRNA-200c 表達明顯下調，使E-cadherin 的表達受到了明顯抑制，而β-catenin 則表達增加并入核。E-cadherin 的表達下調，促進了EMT 的發生，β-catenin 入核后在細胞膜的低表達通過影響E-cadherin/β-catenin 復合物的形成，也促進了EMT的發生，導致了造釉細胞型顱咽管瘤的侵襲性增加。