SLCO1B1 在肝細胞癌中的表達及其對患者預后的影響

唐 菀，張曉珣，柴 進

（陸軍軍醫大學第一附屬醫院/西南醫院消化內科，重慶 400038）

目前，肝細胞癌（hepatocellular carcinoma）已成為一種全球性常見的消化系統腫瘤之一，是我國第4位常見惡性腫瘤及第2 位腫瘤致死病因[1，2]。雖然手術治療可提高肝細胞癌患者的總體生存預后，但術后并發癥和復發率很高，治療效果欠佳。腫瘤微環境是腫瘤賴以存在的根本，它為腫瘤的增殖、轉移和侵襲提供了物質基礎。腫瘤發生、生長和轉移與其所處內外環境密切相關，既包含腫瘤所在區域的組織結構等，也包含腫瘤細胞本身所處的內在環境[3]。腫瘤細胞可以通過自分泌、旁分泌等方式，改變并維持其生存與發展條件，從而促進腫瘤的生長。全身及局部組織也可通過改變代謝、分泌、免疫等，限制和影響腫瘤的發生與發展[4]。術后轉移是肝癌高復發的重要原因。因此，探尋肝癌轉移復發相關的分子機制對于提高肝癌遠期療效具有重要意義。有機陰離子轉運體多肽（organic anion transporting polypeptides，OATPs）家族是溶質載體的一個重要超家族，其由SLCO 基因家族編碼。OATPs 廣泛分布在全身各種器官與組織中，可以調節多種內外源性化合物和常用處方藥物的轉運，包括他汀類藥物、甲氨蝶呤和抗高血壓藥物等[5]。OATPs 以鈉離子非依賴的方式進行底物轉運，所有OATPs 均包含12 個跨膜結構域，在第9 和第10 跨膜區域之間存在著一個胞外環，它含有許多保守的半胱氨酸殘基，類似于DNA 結合蛋白的鋅指結構域，這種結構特征是OATPs 發揮各種功能的關鍵[6]。目前，已鑒別出的人源性OATPs 有11 種，其中研究最多的為OATP1 亞家族。而在肝癌和癌旁肝組織中表達差異明顯的基因SLCO1B1 編碼有機陰離子轉運蛋白家族成員OATP1B1。OATP1B1 是一種跨膜受體，能特異性地表達于肝細胞基底膜上，主要參與腸肝循環和肝臟代謝清除等過程。研究顯示，OATP1B1 在HepG2 肝癌細胞中的表達較低[7]，且與正常組織相比，它在肝癌組織中的表達減少[8]。除在肝癌中有表達，OATP1B1 在多種腫瘤細胞與組織中有表達。研究表明[9]，通過誘導OATP1B1 在卵巢癌細胞中高表達，有利于增強抗腫瘤藥的治療效果；此外，OATP1B1 在結腸癌中的表達高低，與結腸癌的分化密切相關[10]。可以看出，OATP1B1 的表達水平對腫瘤的治療效果可產生較大的影響。目前，關于OATP1B1 在肝細胞癌組織中表達降低的機制尚不明確。因此，本研究利用生物信息學方法分析肝細胞癌患者中SLCO1B1 基因的表達，探討其與患者臨床預后以及免疫浸潤水平的相關性，為臨床的診療工作提供參考。

1 資料與方法

1.1 數據來源 利用TIMER、Kaplan-Meier plotter、TISIDB、GEPIA 等數據庫獲取關于肝細胞癌的數據，并分析相關基因變化。

1.2 TIMER 分析 在TIMER2.0 數據庫（http://timer.cistrome.org/），選中Exploration 的Gene_DE 模塊；在Gene expression 中鍵入SLCO1B1，提交即可得到SLCO1B1 在不同腫瘤中的表達情況。在TIMER 數據庫（https://cistrome.shinyapps.io/timer/），選中Gene模塊，進入Gene-免疫細胞浸潤相關性頁面；鍵入基因名稱SLCO1B1，選擇目的腫瘤LIHC，提交分析SLCO1B1 的表達水平與肝細胞癌組織內免疫細胞浸潤的相關性。進入TIMER 數據庫，導航欄中選擇Survival，腫瘤類型中輸入LIHC，免疫細胞種類默認選 擇B cell、CD8+T cell、CD4+T cell、Macrophage、Neutrophil、Dendriticcell，GeneSymbols 輸入SLCO1B1，隨后右側即彈出Cox 風險模型相關結果，提取結果進行整理。

1.3 Kaplan-Meier 生存曲線分析 進入Kaplan-Meier plotter 數據庫（http://kmplot.com/analysis/），點擊Liver cancer 選項，鍵入基因名SLCO1B1，選擇中位值作為該基因表達高、低的切分點，依次選中OS、RFS、PFS 和DSS 點擊繪圖，即可獲得SLCO1B1 表達水平與肝癌患者預后情況的關系。在Kaplan-Meier plotter 數據庫，點擊Liver cancer 選項進入肝癌亞組的預后分析；在跳轉的頁面中，鍵入目的基因SLCO1B1，選擇以中位值作為區分基因表達高、低表達的分界線，在survival 中選中OS 或PFS，而在臨床指標中則依次選中Stage、Grade、AJCC_T、Gender、Race、Alcohol consumption、Hepatitis virus，最后點擊繪圖，即可得到在不同的臨床病理條件下相應的HR值和以及P值。

1.4 TISIDB 分析 進入TISIDB 數據庫（http://cis.hku.hk/TISIDB），在基因欄中輸入SLCO1B1，點擊提交后頁面跳轉，選擇Lymphocyte，右側選項欄中設置X軸癌種為LIHC，分別點擊調整Y 軸為28 種淋巴細胞，繪制散點圖，提取相關系數R和P值，匯總整理即為SLCO1B1 表達與人肝細胞癌淋巴細胞浸潤的關系。

1.5 GEPIA 分析 在GEPIA 數據庫（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html），選擇Multiple Gene Analysis模塊下的Correlation analysis 選項；在相關性分析模塊中，在基因A 中鍵入SLCO1B1，而在Gene B 中依次鍵入免疫細胞標記基因名，相關系數選擇為Spearman，而TCGA Tumor 和TCGA Normal 中則分別選中LIHC Tumor 和LIHC Normal 添加至右側的數據集中，提交即可得到每個基因與SLCO1B1 的相關性系數，提取結果進行整理。

1.6 統計學方法 通過整合基因表達信息和臨床預后價值進行統計分析以及驗證生存相關分子標志物SLCO1B1，經Log-rank 檢驗分析患者生存狀況的差異。采用Cox 比例風險模型檢驗SLCO1B1 水平和腫瘤浸潤性免疫細胞與LIHC 患者預后的關系。Spearman 相關分析表征相關性程度，相關系數越接近0，相關關系越弱；越接近-1 或+1，證明相關關系越強。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SLCO1B1 在肝細胞癌中的表達 通過檢索TIMER 數據庫中測定的mRNA 水平發現，與癌旁正常組織相比，SLCO1B1 在人肝細胞癌組織中的表達降低。并且在其他腫瘤如膽管癌（CHOL）中，SLCO1B1也呈低表達。此外，與癌旁正常組織相比，SLCO1B1在膀胱移行細胞癌（BLCA）、食管癌（ESCA）、肺鱗狀細胞癌（LUSC）等腫瘤中表達略高，見圖1。

圖1 SLCO1B1 在不同腫瘤中的表達情況

2.2 SLCO1B1 表達與肝細胞癌患者生存預后的關系與SLCO1B1 低表達組相比，SLCO1B1 高表達組的總生存期（OS）（n=364，P=0.0037）、無復發生存期（RFS）（n=313，P=0.011）、無進展生存期（PFS）（n=366，P=0.0017）、疾病特異性生存期（DSS）（n=357，P=0.024）均提高。SLCO1B1 是預測肝細胞癌預后的一個保護性因素，SLCO1B1 高表達的肝細胞癌患者預后較好，見圖2。

圖2 SLCO1B1 在肝細胞癌中的預后意義

2.3 SLCO1B1 表達與肝細胞癌患者臨床特征的相關性 在男性、亞洲人、飲酒、未感染肝炎病毒的肝細胞癌患者中，SLCO1B1 mRNA 低表達的總生存期和無進展生存期更差；在1 期、2 期、1 級、3 級、女性、不飲酒、感染肝炎病毒等肝細胞癌患者中，SLCO1B1的表達與總生存期和無進展生存期無關，見表1。

表1 SLCO1B1 表達與肝細胞癌患者臨床預后的相關性

2.4 肝細胞癌中SLCO1B1 表達水平與免疫細胞浸潤水平的相關性 SLCO1B1 在肝細胞癌中的低表達與大多數免疫細胞的高浸潤水平相關，其中SLCO1B1的表達水平與肝癌組織中B 細胞（r=-0.176，P=1.06e-03）、CD8+T 細胞（r=-0.159，P=3.11e-03）、CD4+T 細胞（r=-0.139，P=9.99e-03）、巨噬細胞（r=-0.15，P=5.60e-03）、中性粒細胞（r=-0.069，P=1.98e-01）、樹突狀細胞（r=-0.164，P=2.43e-03）的浸潤水平呈負相關，而與腫瘤純度（r=0.009，P=8.7e-01）呈正相關，見圖3。SLCO1B1 與28 種腫瘤浸潤性免疫細胞亞型的關系：SLCO1B1 與活化CD8+T 細胞、活化CD4+T 細胞、中樞記憶CD4+T 細胞、濾泡輔助性T 細胞、γδT 細胞、CD56+自然殺傷細胞、髓源性抑制細胞、活化樹突細胞呈負相關，而與記憶B 細胞、嗜酸性粒細胞呈正相關，見表2。此外，Cox 比例風險模型顯示，B 細胞、CD8+T 細胞、樹突狀細胞、SLCO1B1 表達水平與肝細胞癌患者臨床預后相關，見表3。

表2 SLCO1B1 表達與人肝細胞癌淋巴細胞浸潤的關系

表3 SLCO1B1 和腫瘤浸潤性免疫細胞在肝細胞癌中的Cox 比例風險模型

圖3 SLCO1B1 表達水平與肝細胞癌組織內免疫細胞浸潤的相關性

2.5 肝細胞癌中SLCO1B1 表達水平與免疫細胞標志物的相關性 SLCO1B1 在肝癌組織中的表達與輔助性T 細胞2（Th2）、調節性T 細胞（Treg）、T 細胞耗竭（T cell exhaustion）、濾泡輔助性T 細胞（Tfh）、輔助性T 細胞17（Th17）、CD8+T 細胞（CD8+T）、T 淋巴細胞（T cell）、B 淋巴細胞（B cell）、腫瘤相關巨噬細胞（TAM）、M1 型巨噬細胞（M1 Macrophage）和樹突狀細胞（DC）標記基因的表達相關。其中，輔助性T 細胞2 標志物STAT6，調節性T 細胞標志物TGF-β，T 細胞耗竭標志物CTLA4、PD-1、LAG3、GZMB，濾泡輔助性T 細胞標志物BCL6，輔助性T 細胞17 標志物STAT3，CD8+T細胞標志物CD8B，T 淋巴細胞標志物CD3D，M1 型巨噬細胞標志物NOS2，樹突狀細胞標志物HLA-DQB1均與SLCO1B1 的表達有關，見表4。

表4 SLCO1B1 表達與免疫細胞標記基因的相關性

表4（續）

3 討論

肝細胞癌是一種高死亡率的原發性肝癌。它是一種全球范圍最常見的惡性腫瘤，尤其是在亞洲、非洲和南部歐洲[11，12]。肝癌的癌變過程中可能伴隨著一種或多種血清腫瘤標志物的升高，單項檢測或多項聯合檢測可顯著提高肝癌診斷的陽性率。

OATPs 家族成員對藥物的運輸作用是人體內最重要的細胞藥物攝取機制之一。有研究表明[13]，攝取轉運體可以增加對抗癌藥物如甲氨蝶呤等的敏感性。OATPs 家族與腫瘤之間關系密切，如有研究表明抑制OATP1A2 會抑制人食管鱗狀細胞癌的進展和預后[14]。Nakanishi T 等[15]指出OATP2A1 可能通過將PGE2 攝取到內皮細胞中來促進小鼠結腸癌的發生。Ueno A 等[16]證實OATP1B3 上調的肝細胞癌可能代表Wnt/β-catenin 激活的肝細胞癌的特定亞類。特別的是，有研究表明[17，18]，OATP1B1 對索拉非尼在肝細胞癌中的轉運和治療效果有重要作用，這提示OATP1B1（SLCO1B1）在肝癌組織中的表達水平可能對于肝癌患者的預后有重要影響。

本研究顯示，SLCO1B1 基因在肝細胞癌及癌旁組織中表達水平存在差異，與正常組織相比，SLCO1B1 在肝細胞癌組織中的表達降低。Kaplan-Meier 分析結果表明，SLCO1B1 高表達的肝細胞癌患者預后較好，提示SLCO1B1 是預測肝細胞癌預后的一個保護性因素。另外，SLCO1B1 的表達在肝細胞癌患者的某些臨床特征，如男性、亞洲人、飲酒、未感染肝炎病毒等中具有預后意義。在這些患者中，SLCO1B1 的低表達表現為相對更差的總生存期和無進展生存期。推測在肝細胞癌中SLCO1B1 可能通過影響細胞周期進程，如抑制細胞增殖、促進細胞凋亡等，影響肝細胞的發生發展，其在肝細胞癌的發生發展中表現出一定的生物學作用。

有研究指出[19]，腫瘤微環境中免疫細胞浸潤與肝癌預后具有明顯相關性。本研究結果顯示，SLCO1B1 在肝細胞癌中的低表達與B 細胞、CD8+T細胞、CD4+T 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞等免疫細胞在腫瘤中的高浸潤水平相關。B 細胞能夠產生抗體，是體液適應性免疫的關鍵細胞，也是腫瘤微環境重要的免疫細胞[20]。巨噬細胞是組織駐留的分化單核細胞，其吞噬活性根據其分化狀態和功能作用通常分為M1 和M2 亞型，M1 和M2 型巨噬細胞在腫瘤預后中均具有一定的預測價值[21,22]。而中性粒細胞是最豐富的循環白細胞，具有吞噬和抗菌能力。在癌癥中，中性粒細胞計數的增加與不良總生存期相關[23]。樹突狀細胞則是形成T 細胞活化和分化的關鍵專業抗原提呈細胞，其由不同功能、形態、表型和分布的特定樹突狀細胞亞群組成，不同的亞群與不同的預后相關[24]。其作為細胞免疫的主體類群，T 細胞在腫瘤免疫細胞殺傷中具有重要作用。在腫瘤微環境中，CD8+T 細胞可以對腫瘤細胞造成殺傷作用，而CD8+T 細胞主要通過CD4+T 細胞中Treg 細胞進行調節[25]。本研究進一步分析結果顯示，SLCO1B1 與肝細胞癌的16 種免疫細胞亞型相關。表明SLCO1B1 可能是肝細胞癌中一種主要的腫瘤免疫浸潤調節因子。為了充分證明SLCO1B1 的表達與肝細胞癌中免疫細胞的浸潤有關，本研究利用GEPIA 數據庫研究了肝細胞癌中SLCO1B1 表達水平與免疫細胞標志物的相關性。根據背景和腫瘤類型，免疫細胞可以是促腫瘤發生的，也可以是抗腫瘤發生的。肝細胞癌中大量免疫細胞如腫瘤相關巨噬細胞的浸潤可以對肝癌的發生發展起到正向作用[26]，且由于腫瘤微環境的免疫抑制造成CD8+T 細胞（腫瘤殺傷性T 細胞）處于免疫疲憊（抑制）狀態[27]，這樣的雙重作用導致了肝癌的不良預后。盡管如此，免疫細胞的浸潤水平對肝癌的預后評判并不全面，對于腫瘤需要考量更多的變量，如腫瘤進展分期等。

綜上所述，SLCO 基因家族成員SLCO1B1 是一種與免疫浸潤相關的肝細胞癌預后生物標志物，可以用來評估腫瘤組織中免疫細胞浸潤的水平。其中低表達SLCO1B1 的肝細胞癌患者預后較差，這可能與腫瘤免疫微環境被重塑有關，提示SLCO1B1 可以作為一種新的肝細胞癌治療靶點，然而其具體的分子機制仍有待生物學實驗進一步驗證。