蒼術不同部位中揮發油的資源評價研究

王興源，張 杰，趙建華，羅思凡，王 欣，王飛娟

（陜西國際商貿學院醫藥學院，陜西 西安 712046）

蒼術為菊科植物茅蒼術Atractylodes lancea (Thunb.)DC.或北蒼術Atractyl odes chinensis (DC.) Koidz.的干燥根莖，臨床上可用于脘腹脹滿、風濕痹痛及風寒感冒等[1]。蒼術熏蒸空氣能夠解郁避穢，在病房、產房及手術室等均取得了滿意效果，而其揮發油為殺菌的主要活性成分[2-3]。氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）技術常用于中藥揮發油的研究[4-5]，對于蒼術揮發油的提取多使用根莖部位，而其地上部分資源的利用缺乏，有待深入研究。本研究通過提取北蒼術葉片和根莖中的揮發油，并對揮發油進行GC-MS 分析以及實驗室抑菌實驗，為實現蒼術地上部分的綜合利用提供實驗依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

日本島津GC8040 型氣相色譜-質譜聯用儀；BSA 323S 型電子天平為賽多利斯科學儀器（北京）有限公司生產；MH-1000 電熱套于北京科偉永興儀器有限公司購買；QE-100 型高速粉碎機購買于浙江屹立工貿有限公司；XSE105DU 型電子天平（METTLER TOLEDO）；RE2000B 型壓力蒸汽滅菌鍋生產于河南鞏義市予華儀器有限公司；96 孔微量板；普通培養箱。

無水硫酸鈉、乙醚、葡萄糖、氯化鈉、氫氧化鈉、碘硝基四唑紫（均為分析純），蒸餾水。PB 及PDA 培養基。抗菌活性實驗所用標準菌株凍干品由陜西國際商貿學院醫藥學院微生物學實驗室提供。

實驗用蒼術經陜西國際商貿學院醫藥學院賴普輝教授鑒定為菊科蒼術屬植物北蒼術的干燥根莖和葉片。

1.2 蒼術揮發油的提取

將蒼術葉置于裝有95%乙醇中加熱約30min 后干燥，以去除葉中的葉綠素。將蒼術根莖430g（粉碎至20 目）及蒼術葉200g 放于3000ml 的圓底燒瓶中，加入蒸餾水1000ml、重蒸乙醚200ml 蒸餾萃取4 小時，用無水Na2SO4去除萃取液中的水分并減壓回收乙醚，即得淡黃色蒼術揮發油，冷卻后為淡黃色固體，分別放入4℃冰箱保存待用。

1.3 GC-MS 工作條件

GC8040 型GC-MS 儀，色譜柱型號：Thermo TR-5-MS 毛細管質譜柱（30m×0.25mm×0.33μm）；流動相為氦氣，流量為1.0ml/min，進樣口溫度150℃；柱 溫60 ℃，以5 ℃/min 升 至80 ℃，保 持1min，以10℃/min 升至180℃，保持3min，再以15℃/min 升至250℃，保持5min；掃描模式：采用全掃描，選擇質量30～350amu，EI 方式電離，電子能量70eV，離子源溫度200℃，傳輸線溫度250℃。分析方法：通過與計算機NIST 譜庫對比各色譜峰對應的質譜圖定性，根據總離子流圖采用面積歸一法計算其相對含量。

1.4 培養基的制備

細菌培養基的制備（PB 培養基）：準確稱取3g 牛肉膏、10g 蛋白胨、5gNaCl 后加適量蒸餾水，用電爐加熱攪拌至其充分溶解，再加入15g 瓊脂粉使其融化后加水定容至1000mL。溶液冷卻至室溫后，用1mol/L 的氫氧化鈉調節溶液的PH 值至7.3，再將其裝入不同的錐形瓶中牛皮紙封好瓶口，用高壓蒸汽滅菌鍋（121℃，20min）滅菌后備用。

真菌培養基的制備（PDA 培養基）：將去皮的馬鈴薯切成塊狀并稱取200g，用適量蒸餾水煮沸（20～30min）后用雙層紗布過濾除去雜質，再加葡萄糖20g，瓊脂15g，加水定容至1000mL。待溶液冷卻至室溫后，用1mol/L 的氫氧化鈉調節至溶液的PH 值為5.6，再將其傾倒于不同的錐形瓶中用牛皮紙封好瓶口，用高壓蒸汽滅菌鍋（115℃，20min）滅菌即得。

1.5 抑菌活性的測定

選擇濾紙片法對揮發油的抑菌活性進行檢測[6-7]。以無水乙醇作為溶劑，分別將蒼術根莖和葉片揮發油配制成50mg/mL 的溶液。在無菌環境下，滴加試菌液0.1mL 于培養皿的平板表面上涂勻，并將滅菌的濾紙片（d=6mm）分別在樣品溶液中浸潤30min，待濾紙片充分吸收試液后取出瀝干貼于平板表面中央，每個培養皿貼兩個濾紙片，其中兩個小紙片分別為空白對照組（無水乙醇）和揮發油溶液組。用大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌各做三組平行，放置平整后輕壓使濾紙片緊貼于平板表面，蓋上平皿蓋靜置30min 后置于恒溫培養箱中進行培養。37℃下培養細菌24h，28℃下培養真菌48h。最后通過肉眼觀察結果并測量各組蒼術揮發油對4 種供試菌種的抑菌圈直徑。

1.6 抗菌實驗

最低抑菌濃度（MIC）的測定：本實驗在參考文獻[8]的基礎上稍作改動，采用微量稀釋法對蒼術根莖和葉片中揮發油的最低抑菌濃度進行考察。在96 孔板中，供試樣品孔為第1 列至8 列，空白對照孔為第9列。每孔中加入100μL 液體培養基后，利用倍比稀釋法將其分為不同稀釋濃度，即濃度梯度依次為25%、12.5%、6.25%、3.13%、1.57%、0.78%、0.39%、0.20%（V/V）。將50μL 不同濃度的揮發油藥液依次加入96 孔板中，其中空白對照組加入50μL 無水乙醇，并按順序向每孔中滴加50μL 菌液，每個濃度設置3 個復孔作為平行。37℃下培養細菌24h，28℃下培養真菌48h。每孔加入0.2g/L 的碘硝基四唑紫溶液50μL，若出現紫色則表明有活菌，首次出現紫色的溶液濃度則為蒼術揮發油的最低抑菌濃度。

最小殺菌濃度（MBC）的測定：采用平板轉種法測定MBC[9]。依次用無菌生理鹽水稀釋平板未生長孔的培養物（≥MIC）20 倍后，取0.05ml 接種在瓊脂平板上，并在培養箱（37℃，24h）條件培養。此時，細菌未生長區域的最小藥物濃度可認為是該揮發油的最小殺菌濃度。

2 結果

2.1 蒼術揮發油成分分析

在上述氣相色譜試驗條件下，北蒼術的根莖和葉片揮發油中分離出的峰數量分別為54 個、50 個。通過NIST 譜庫定性及文獻資料[10]直觀比較蒼術揮發油成分的基峰及相對豐度等，分別鑒定出化合物50 個、47 個。通過分析面積歸一法測得上述化合物在根莖和葉片揮發油總組分中的含量分別為98.4%和95.2%。

結果顯示，蒼術根莖和葉片中揮發油成分含量較高的均為4-聯苯甲醛，八氫四甲基萘甲醇、桉葉烯和茅術醇等，但并未檢出蒼術酮和蒼術素。研究顯示，提取方法及所選溶劑的不同是影響蒼術揮發油抽提成分不同的重要因素。賈春曉等[11]采用蒸餾萃取法和索氏提取法分別鑒定出蒼術揮發油化合物49 種、22 種，同時以二氯甲烷、無水乙醚和正己烷為溶劑進行抽提所得成分也各不相同。本研究使用水蒸氣蒸餾法提取出蒼術揮發油的有效成分主要為C15等倍半萜類成分，這可能與該實驗所采用的揮發油提取方式及MS 的分離條件有關。

2.2 抑菌活性分析

蒼術不同部位對4 種菌種的抑制作用結果顯示，蒼術根莖和葉片揮發油均有一定的抑菌效果，而抑菌活性卻有差別。根莖揮發油和葉片揮發油對4 種菌種的抑菌效果一致，無顯著差異。其中兩部位所提取的揮發油對大腸桿菌及枯草芽孢桿菌的抑制作用較金黃色葡萄球菌、白色念珠菌次之。

2.3 抗菌活性結果分析

為進一步驗證不同部位的蒼術揮發油抑制作用，本實驗采用倍比稀釋法研究其對不同試驗菌種的MIC和MBC。

由此可知，兩部位提取的蒼術揮發油對不同菌株的MIC 結果一致，且其對G+（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）及真菌（白色念珠菌）的抑制作用較強，對G-（大腸桿菌）的作用較弱。

蒼術不同部位揮發油對供試菌株的MIC 范圍在0.79%～1.58%（V/V）。其中兩部位提取的揮發油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的MIC 值均為0.79%（V/V），對枯草芽孢桿菌的MIC 值為1.58%（V/V）；而其對不同菌株的MBC結果有差異，范圍在1.58%～12.5%（V/V）。

3 討論

本研究通過分析水蒸氣蒸餾法提取的北蒼術根莖和葉片中揮發油的成分及含量，并對其揮發油的生物活性進行初步驗證。

結果表明，蒼術不同部位揮發油化學成分復雜多樣且以萜類成分為主，其中含量較高的均為4-聯苯甲醛，八氫四甲基萘甲醇、桉葉烯和蒼術醇等，這與李迎春等的研究中揮發油中的主要成分相一致[12]，說明植物與其所含化學成分有一定的相關性。而北蒼術葉片中所含的揮發油成分與習用部位（根莖）的化學成分相一致且其相對含量的差異亦并不明顯，提示北蒼術的葉片也有潛在利用價值，為蒼術藥用資源的綜合利用及開發奠定了一定的理論依據。

抑菌活性分析結果顯示，北蒼術根莖與葉片中的揮發油對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌及白色念珠菌均有抑制作用，且蒼術不同部位提取的揮發油對同一供試菌種的抑制效果無明顯差異。抑菌圈的大小能夠反映病菌對藥物的敏感度，即抑菌圈直徑越大該病菌對藥物越敏感。

本研究結果顯示，蒼術揮發油對大腸桿菌及枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑較金黃色葡萄球菌、白色念珠菌小，提示蒼術根莖與葉片中的揮發油對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的抑制作用較強，對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌的抑制作用較弱。

抗菌活性的實驗結果表明，不同部位的蒼術揮發油對不同菌株的最小抑菌濃度結果一致，對實驗所選用的4 種菌株均有明顯的抑制和滅活作用。其中，以G+及真菌的抑制作用較強，這也與金詩鳳等、施綺云等利用蒼術作為空氣消毒劑的研究結果相同[13-14]。由于北蒼術揮發油化學成分的復雜多樣性[15]，本實驗僅驗證了其部分抗菌的生物活性，抗菌殺菌實驗有待進一步研究。

綜上，提取的蒼術根莖及葉片揮發油的化學成分相一致，且蒼術葉片亦具有抑菌抗菌活性，為蒼術全珠資源的開發利用奠定了理論基礎。而本研究僅采用水蒸氣蒸餾法提取了不同部位蒼術揮發油，后續亦可通過不同提取方法及溶劑萃取分離出不同的蒼術揮發油成分，并選用不同的菌種進行相應的活性研究，以期為蒼術的綜合利用及資源開發提供參考。