CDK1和CCNB1表達水平在肝細胞癌中的臨床意義

朱文文，肖葛瓊

(紹興文理學院附屬醫院 腫瘤內科，浙江 紹興 312000)

原發性肝癌是癌癥致死的第2大原因，其中肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占90%以上[1]。HCC是全球第5大最常見的癌癥類型，并且其發病率呈逐年升高趨勢[2]。許多HCC患者到了疾病晚期才被確診，錯過了手術和治療的最佳時機，并且 HCC患者的五年生存率并不理想[3]。因此實現HCC的早期診斷是臨床研究的重點之一。

既往研究挖掘了和HCC組織惡性發展相關的潛在關鍵基因，包括細胞周期蛋白B1(cell cycle-related proteins cyclin B1, CCNB1)、細胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase 1,CDK1)[4-5]。CCNB1、CDK1在HCC中具有潛在的應用價值[6-8]，但目前相關的臨床研究還比較少。本研究分別從診斷、預后以及與臨床病理分期的相關性上，分析CDK1和CCNB1表達水平在HCC中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年6月—2015年6月紹興文理學院附屬醫院腫瘤科收治的HCC患者112例。男性72例、女性40例，60歲以上39例、60歲及以下73例；病理分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期37例，Ⅲ期54例，Ⅳ期12例。納入標準：①經影像學和術后病理學檢查確診為HCC；②術前未接受過放化療；③臨床資料完整；④對本研究知情同意。排除標準：①轉移性肝癌；②嚴重心、肺、腎等器官功能不全；③合并其他惡性腫瘤；④合并免疫性疾病；⑤合并血液系統疾病。在患者手術過程中獲取其HCC組織以及配對的癌旁正常組織。本研究已獲得本院倫理委員會批準。

1.2 實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測CDK1與CCNB1的相對表達量 通過Trizol試劑(Invitrogen，USA)從組織中提取總RNA，然后使用Superscript Ⅱ試劑盒(Invitrogen，USA)進行反轉錄。使用DBIBestar?SybrGreen qPCR試劑盒，通過實時PCR(Stratagene Mx3000P)對mRNA的水平進行定量。在SYBR Green Supermix(Bio-Rad，USA)和ABI Prism 7700系統(Applied Biosystems，USA)構建下進行PCR。一式3份分析樣品，并用2-ΔΔCt方法分析。GAPDH用于內部對照。引物設計見表1。

表1 引物序列表

1.3 隨訪 手術后對患者進行為期5年的隨訪，隨訪截止時間為2020年6月。記錄患者的無進展生存期(progression-free survival, PFS)和總生存期(overall survival, OS)。隨訪期間無病例脫落。

1.4 統計學方法 應用SPSS和GraphPad Prism進行統計分析。2組間計數資料比較采用t檢驗，診斷價值通過ROC曲線進行分析，通過Pearson線性和Spearman秩相關性分析分別評估正態資料和等級資料的相關性，log-rank test和Gehan-Breslow-Wilcoxon test對生存曲線進行差異分析，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC組織中CDK1和CCNB1的表達水平 qRT-PCR檢測結果顯示，HCC患者癌組織中的CDK1、CCNB1表達水平均高于配對的癌旁正常組織，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖1。

A.正常組織和HCC組織中CDK1的表達水平；B.正常組織和HCC組織中 CCNB1的表達水平；** P<0.01。

2.2 HCC組織中CDK1和CCNB1二者間及與HCC病理分期的相關性 Pearson相關性分析結果表明，HCC組織中CDK1和CCNB1的表達水平顯著正相關(r=0.769，P<0.01)，見圖2 A。Spearman相關性分析結果顯示，CDK1和CCNB1的表達水平均與HCC病理分期顯著正相關(r=0.828、0.726，均P<0.01)，見圖2 B、2 C。

A. CDK1與CCNB1表達水平的相關性；B. CDK1表達水平和病理分期相關性；C. CCNB1表達水平和病理分期相關性。

2.3 CDK1、CCNB1在HCC中的診斷價值 將癌旁正常組織中CDK1和CCNB1的表達水平作為對照組，進行ROC分析，結果顯示：CDK1診斷HCC的AUC為0.817，敏感度和特異性分別為87.5%、71.4%，cut-off值為1.377；CCNB1診斷HCC的AUC為0.810，敏感度和特異性分別為92.0%、64.3%，cut-off值為1.395；CDK1和CCNB1聯合診斷HCC的AUC為0.837，敏感度和特異性分別為83.0%、77.7%。見圖3。

A.單獨診斷HCC；B.聯合診斷HCC。

2.4 CDK1與CCNB1在HCC中的預后價值 分別以HCC癌組織中CDK1、CCNB1表達的中位值，將患者分為CDK1高表達組、CDK1低表達組、CCNB1高表達組以及CCNB1低表達組，隨訪5年，統計患者的PFS和OS。結果表明， CDK1和CCNB1高表達的HCC患者的PFS和OS均短于低表達者，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 CDK1(A、B)與CCNB1(C、D)不同表達水平的HCC患者生存分析曲線

3 討論

盡管關于HCC的外科手術技術、綜合治療和針對性療法都在不斷發展，但目前HCC患者的總生存率仍然不理想[9]。因此實現HCC的早期診斷是臨床研究的重點之一。目前甲胎蛋白(AFP)是臨床上用于診斷HCC最常用的一項腫瘤標志物，但其診斷的敏感度不夠理想，存在一定的局限性[10]。CDK1是一種重要的周期調節蛋白，也是CDK家族中唯一可以獨立調節細胞周期的蛋白[11]。已有研究報道表明，二甲雙胍通過上調miR-378和下調CDK1來發揮對HCC的抑制能力[6]，而上調CDK1基因的表達能夠促進HCC的發生和惡性發展[12]。此外，CCNB1和CCNB2可以與CDK1形成復合物，進而參與調控細胞周期過程[7]。Gu等[8]的研究報道通過裸鼠成瘤實驗驗證了miR-144負調節CCNB1并抑制瘤體生長。因此，本研究希望通過探究CDK1和CCNB1在HCC中臨床價值，進而發現全新的生物標志物。

之前的研究表明，CDK1和CCNB1在橫紋肌肉瘤中均顯著高表達，且其高表達有一定的臨床診斷價值[13]，與本研究結果一致。這種表達失調是否具有診斷價值目前也尚未發現相關臨床文獻，在本研究中我們通過ROC分析得知CDK1和CCNB1表達水平均具有較好的臨床診斷價值，CDK1的診斷價值和特異性要優于CCNB1，且二者聯合診斷更進一步提升了診斷價值和診斷的特異性。相關文獻[14-16]表明，CDK1和CCNB1的表達水平二者間存在很高的相關性，并且分別和不同腫瘤的臨床病理特征存在一定的相關性。本研究中， HCC患者的癌組織中CDK1和CCNB1的表達水平顯著正相關，CDK1表達水平、CCNB1表達水平均和HCC病理分期顯著正相關，其中CDK1和HCC病理分期的相關性更高一些。相比于CCNB1，CDK1在獨立診斷和病理分期相關性分析上均具備一定的優勢。

Zhu等[17]發現CDK1高表達促進5-氟尿嘧啶耐藥的結直腸癌細胞的惡性進展，且與結直腸癌患者的預后不良相關。也有報道[18-19]表明，CCNB1在乳腺癌和胃癌中是潛在的預后標志物。在本研究中，我們發現CDK1、CCNB1低表達組HCC患者的無進展生存期和總生存期均顯著長于CDK1、CCNB1高表達組。可見，CDK1、CCNB1的低表達與HCC患者較好的預后顯著相關，CDK1和CCNB1對HCC患者的預后評估有一定價值。

綜上所述，本研究發現CDK1和CCNB1在HCC中具有較高的診斷價值和預后價值，與病理分期呈顯著正相關，兩者都具備較高的臨床價值。此外本研究還發現HCC患者組織中的CDK1和CCNB1表達水平間存在相關性，表明兩者之間或許存在調控關系，在今后的研究中可就此進行深入探究。