高溫脅迫下景寧木蘭淀粉與蔗糖代謝途徑轉錄分析

鄭晨璐，王倩穎，陸丹迎，申亞梅，馬晶晶，劉 璐，王 云

（1.上海交通大學 設計學院，上海 200240；2.浙江農林大學 風景園林與建筑學院，浙江 杭州 311300）

高溫脅迫不僅導致植物表型的變化，而且會引起植物體內細胞穩態失衡，生長發育受到抑制，嚴重影響觀賞植物的品質[1]。環境溫度的變化對植物光合作用的多種生理生化過程有直接的影響，包括光合碳固定和還原、蔗糖合成、光合產物的運輸與分配等[2]。碳同化是光合作用中植物在同化力形成之后的第3個階段，此階段中，植物葉綠體基質中的Rubisco酶利用ATP和NADPH同化二氧化碳(CO2)生成淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖等物質。在高等植物光合作用中，果糖-1,6-二磷酸酶(Fructose-1, 6-diphosphate synthase, FBPase)在卡爾文循環和細胞質中的蔗糖生物合成途徑中都起著關鍵作用，其中存在至少2種酶：葉綠體型FBPase和胞質型FBPase。葉綠體型FBPase主要參與還原磷酸戊糖途徑，同時參與葉綠體中淀粉的合成；胞質型FBPase主要參與糖異生途徑和蔗糖的合成，在蔗糖的合成中起著重要的調節作用[3?4]。有研究指出蔗糖磷酸合酶 (sucrose diphosphate synthase, SPS)與淀粉積累呈現負相關關系，而與蔗糖形成呈正比關系[5?6]，并與蔗糖合成酶(sucrose synthase, SS)一起成為蔗糖調節的關鍵酶[7]，為淀粉合成提供底物及能量。淀粉是植物體中碳水化合物的主要儲存形式，葉片中淀粉合成是一個動態的過程[8]。在淀粉合成通路中，腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glocose pyrophosphorylase, AGP)作為限速酶，參與第一步反應，顆粒結合淀粉合酶(granule-bound starch synthase, GBSS)參與直鏈淀粉合成，可溶性淀粉合成酶 (soluble starch synthase, SSS)和淀粉分支酶 (starch branching enzyme, SBE)協作合成支鏈淀粉[7]。這些碳同化產物既是光合作用的產物，同時還是植物呼吸作用的底物，為植物的生長發育提供碳骨架的同時，還可增強植物的抗逆性。為進一步了解植物對高溫的響應，分子生物學與轉錄組學等應用與解析調控植物耐熱的分子基礎，培育了相關觀賞植物品種[1]。

景寧木蘭Magnolia sinostellata是木蘭科Magnoliaceae木蘭屬Magnolia灌木，早春開花，花色淺粉色到粉紅色，具有較高的觀賞價值，具有開發應用價值[9]。全球變暖帶來的極端高溫可能對景寧木蘭的生長發育帶來潛在的威脅。目前已挖掘了景寧木蘭熱脅迫下實時熒光定量PCR 內參基因，但還未深入研究。因此，本研究以景寧木蘭幼苗為對象，采取高溫脅迫處理，研究其糖代謝途徑變化機制，從而探究景寧木蘭對高溫的響應情況，同時為木蘭屬植物的城市應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

景寧木蘭植株均來自浙江省景寧縣草魚塘林場苗圃(海拔1 100 m)。選擇1年生、生長一致的景寧幼苗栽植于裝有土壤與珍珠巖按質量比為1∶1混合的容器中，常規管理。所有樣品均放置于光照培養箱中 [光照 20 μmol·m?2·s?1，溫度 (25±1) ℃，相對濕度 (70±10)%，光照黑暗各 12 h]。當植株生長到 10 cm左右高度時，選取20株健康、長勢均勻的幼苗轉移到溫度設定為40 ℃(H)的光照培養箱中，以25 ℃為對照(ck)。處理0、3、6、9、12、24和48 h時采集景寧木蘭第2～3葉(成熟葉)為樣本，迅速保存在液氮中，用于后續的測定，其中選取ck-24、ck-48、H-24、H-48用于轉錄組測定，每個樣本3次生物學重復。

1.2 糖、淀粉及酶活性測定

蔗糖、淀粉、葡萄糖和果糖質量分數的測定采用改進的苯酚-硫酸法[10]，果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)的測定方法采用CHEN等[11]的方法，蔗糖磷酸合酶(SPS)根據GROF等[12]方法測定。采用SPSS 19.0進行單因素方差分析，采用LSD法進行顯著性差異分析。

1.3 轉錄組測序與數據分析

使用Trizol試劑盒(天根，北京)提取景寧木蘭葉片總RNA。質量檢測合格后，經深圳華大基因科技服務有限公司使用DNaseI消化DNA、富集mRNA并反轉錄合成cDNA和PCR擴增，制備cDNA文庫。用 Agilent 2 100 Bioanalyzer和 ABI StepOnePlusReal-Time PCR System 完成文庫質量和產量檢測后進行轉錄組測序。對原始數據(raw reads)進行質控(QC)獲得濾后的數據(clean reads)，再進行基因定量分析以及基于基因表達水平的各項分析(主成分、相關性、條件特異表達、差異基因篩選等)，并對篩選出的樣品間差異表達基因進行GO功能顯著性富集分析、pathway顯著性富集分析和聚類以及蛋白互作網絡和轉錄因子等深入挖掘分析。

1.4 基因表達量及差異基因分析

用RSEM工具[13?14]進行基因表達定量，運用FPKM法消除基因長度和測序量差異對計算基因表達的影響，計算得到的基因表達量可直接用于比較不同樣品間的基因差異表達。將候選響應基因利用RefSeq non-redundant proteins(NR)數據庫、Swiss-Prot數據庫、Gene Ontology(GO)數據庫和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)數據庫進行 Blast比對，獲得候選響應基因的注釋信息。用WEGO軟件[15]對差異基因做GO功能分類統計，利用Omicshare在線工具庫中的動態KEGG富集分析程序進行候選響應基因的注釋及功能預測。

1.5 實時熒光定量 PCR

將反轉錄產物 cDNA 稀釋 10 倍，使用 SYRB Premix Ex Tap Ⅱ (TAKARA：Code No.RR820A)實時定量PCR試劑盒，使用Light Cycler 480 Ⅱ(Roche)實時定量PCR儀進行定量分析。反應體系為SYRB Premix Ex Tap Ⅱ10 μL，cDNA 模板 2 μL，上下游引物各 0.8 μL(10 μmol·L?1)，ddH2O 6.4 μL，共 20 μL 體系。每個樣品 3 次重復，擴增反應程序為：95 ℃ 預變性 30 s，95 ℃ 變性 5 s，60 ℃ 預變性 30 s，共40個循環。然后95 ℃持續5 s，60 ℃持續1 min，95 ℃持續15 s作為溶解曲線分析程序，進行溶解曲線分析。最后根 2-??Ct法計算目的基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 高溫脅迫對景寧木蘭碳水化合物質量分數與酶活性的影響

與對照相比，高溫脅迫下24和48 h時景寧木蘭的果糖、葡萄糖和蔗糖質量分數增加(圖1A～C)，除高溫脅迫24 h的葡萄糖質量分數與對照無顯著差異外(圖1B)，其他均呈顯著差異(P＜0.05)。與對照相比，高溫脅迫24 h時的淀粉質量分數顯著降低(P＜0.05)，而脅迫48 h時的淀粉質量分數顯著升高(P＜0.05)(圖1D)。FBPase和SPS是蔗糖合成的關鍵酶，與對照相比，FBPase活性在脅迫24 h時先顯著升高(P＜0.05)，在48 h時下降，但差異不顯著(P＞0.05)(圖1E)。在高溫脅迫下，SPS活性相比對照在24 h下降，48 h時有所上升，但并無顯著差異(P＞0.05)(圖1F)。相關性分析結果表明(表1)：蔗糖與果糖變化成極顯著正相關(P＜0.01)，淀粉、SPS活性與FBPase活性成負相關。

表1 高溫脅迫下景寧木蘭碳水化合物質量分數與酶活性的相關系數Table 1 Correlation coefficient between carbohydrate contents and enzyme activities of M.sinostellata under high temperature stress

圖1 不同熱脅迫處理對景寧木蘭碳水化合物同化過程的影響Figure 1 Effects of different heat stress treatments on the carbohydrates assimilation process of M.sinostellata

2.2 高溫脅迫下景寧木蘭葉片的轉錄組測序

轉錄組數據(表2)顯示：測序堿基對總數為7 054 萬～ 7 313 萬條。每個原始讀取從一端測序，長度為50 bp。去除低質量序列后(即含有＜1%的不確定堿基)，各測序樣本共獲得70 547 818(ck-24)、72 966 866(ck-48)、73 134 592(H-24)和73 140 464(H-48) 條。每個庫中clean reads的比例平均為99.53%。來自對照和高溫樣本的轉錄組都有至少7 000萬個clean reads，這表明景寧木蘭轉錄組數據質量較高，能夠開展后續的生物信息學分析。數據篩選后得到的17 884個不同長度的差異unigenes[錯誤發生率(FDR)≤0.001, log2R≥1]。H-24與ck-24相比，4 662個基因的表達下調，6 611個基因的表達上調；H-48與ck-48相比，4 658個基因的表達下調，5 131個基因的表達上調；H-48與H-24相比，4 548個基因的表達下調，4 056個基因的表達上調(表3)。

表2 高溫脅迫和非高溫脅迫下景寧木蘭的葉片測序結果與參考基因序列的對比率Table 2 Ratio of leaf sequencing results to reference gene sequences of M.sinotellata under heat stress and non-heat stress

表3 差異表達基因統計Table 3 Statistic of differentially expressed genes

2.3 GO 功能注釋分類

GO數據庫定義了3類系統來描述基因產物的具體功能：生物過程(biological process)、細胞組分(cellar component)和分子功能(molecular function)，這些基因又被具體分為56個小類，從而發揮生物功能。將組裝的景寧木蘭unigene與GO數據庫比對分析，圖2A～C顯示：景寧木蘭序列中有81 573條unigene可以進行功能分類。其中33.03%的基因顯著富集于生物過程、34.31%的富集于細胞組分，32.66%的分子功能。生物學過程中的主要途徑是細胞途徑和代謝過程相關的轉錄調控，細胞組分中最多的是膜的構成，分子功能中最多的是結合和催化活性。

2.4 KEGG 代謝通路分析

將組裝的景寧木蘭unigene與KEGG數據庫比對及KEGG富集分析(圖2D～E)，結果發現：在景寧木蘭高溫脅迫的3個比較組中，ck-24與H-24、H-24與H-48代謝相關通路高度富集；ck-24與H-24、ck-48與H-48淀粉和蔗糖代謝通路富集排名第3位，H-24與H-48排名第4位。這些結果表明：淀粉和蔗糖代謝途徑在景寧木蘭高溫脅迫響應機制中具有重要作用。

圖2 3個比較組差異基因的GO分類(A～C)和KEGG富集圖(D～F)Figure 2 GO classification (A?C) and KEGG enrichment map (D?F) of DEGs in 3 comparison groups

2.5 熱脅迫誘導的淀粉-糖代謝途徑差異基因表達分析

在淀粉代謝通路中共有105個差異基因。在該通路中，8個DEGs調控ADP-glucose以促進淀粉酶合成，5個DEGs調控淀粉酶以生產淀粉；淀粉也可以通過同樣的途徑調控ADP-glucose產生α-DGlucose-1P，然后再形成UDP-glucose，UDP-glucose再在蔗糖合成酶基因和蔗糖6磷酸合成酶基因的作用下形成蔗糖；蔗糖代謝通路中有17個差異基因，其中有6個屬于蔗糖合酶基因，5個屬于蔗糖磷酸合成酶(圖3A～D)。選取6個淀粉和蔗糖代謝途徑高表達基因，即GP(CL3087.contig2)、SS(Unigene40295)、Glc-1-pa(Unigene38453)、GBE(CL4668.contig3)、SUS(Unigene42760)、SPS(CL651.contig6)，通過 qPCR 定量分析，結果顯示(圖4)：與對照相比，高溫脅迫48 h處理下淀粉和糖代謝途徑上的GP(CL3087.contig2)、SS(Unigene40295)、Glc-1-pa(Unigene38453)、GBE(CL4668.contig3)基因表達顯著上調 (P＜0.05)，SUS(Unigene42760)、SPS(CL651.contig6)基因表達顯著下降(P＜0.05)。由此說明，在高溫脅迫下，淀粉合成酶基因及蔗糖6磷酸合成酶基因表達均呈現上調的趨勢，以促進蔗糖產生。

圖3 高溫脅迫下淀粉-糖代謝途徑及相關基因表達分析圖Figure 3 Analysis of starch and sugar metabolic pathway and related gene expression under high temperature stress metabolism

圖4 淀粉與蔗糖代謝途徑6個DEGs在不同時間點的相對表達Figure 4 Relative expression of 6 DEGs in starch and sucrose metabolism pathways at different time points

3 討論與結論

極端高溫天氣勢必影響植物的生長發育，最終導致部分植物處于瀕危狀態。本研究轉錄組數據顯示：極端高溫處理景寧木蘭之后，其大部分基因可注釋到生物進程，代謝功能途徑中基因分布最多，這與非洲菊Gerbera jamesonii[16]、牡丹Paeonia suffruticosa[1]等相似。景寧木蘭的KEGG數據庫顯示：在高溫處理后，大部分基因高度富集于代謝通路，同時淀粉與糖代謝通路中占據重要的比例。由此推斷，淀粉和蔗糖代謝對景寧木蘭響應高溫脅迫機制具有重要的作用。

植物葉片光合作用同化吸收的碳用于葉綠體淀粉的形成，或者運輸到細胞質中合成蔗糖，蔗糖隨后被運輸到植物的非光合位置。不同植物葉片淀粉和蔗糖積累水平差異很大，環境因子(如溫度、光照等)也影響著植物葉片所固定碳在蔗糖和淀粉之間的分配[17]。本研究中，隨著高溫脅迫的加深，24和48 h處理下景寧木蘭葉片蔗糖和淀粉質量分數差異不顯著，但是均顯著高于對照。本研究中FBPase與淀粉顯著正相關，與蔗糖負相關。這與馬鈴薯Solanum tuberosum[18]、擬南芥Arabidopsis thaliana[19]的研究結果一致。FBPase在24 h達到最高值之后，說明景寧木蘭對高溫具有一定的適應性，然而48 h時與對照相比差異不顯著，說明高溫對景寧木蘭FBPase影響不大。

植物的生長發育所需要的光合產物大部分以蔗糖的形式供應和運輸，其中，SPS是蔗糖合成途徑的一個重要控制點，同時也是蔗糖進入各種代謝途徑所必需的關鍵酶之一，它的活性可反映蔗糖生物合成途徑的能力[20?21]。一些研究指出SPS與淀粉積累呈現負相關，而與蔗糖形成呈正相關[5?6]。本研究結果與之相似。在溫州蜜柑Citurs unshiu‘Miyagawawase’[22]、灌漿期水稻Oryza sativa‘Koshihikari’和O.sativa‘Sasanishiki’[23]的研究中也發現了同樣的問題，可能是因為光合細胞中同化的碳水化合物在蔗糖和淀粉之間的分配受SPS的調節，但SPS不起主要作用，蔗糖和淀粉的合成還受其他因子的影響[24?25]。

淀粉和蔗糖代謝途徑和多種酶密切相關，植物一般利用糖苷鍵將蔗糖[β-D-frucose-(2→1)-α-D-glucose]和海藻糖[α-D-glucose-(2→1)-α-D-glucose]中的己糖殘基連接在一起，蔗糖和海藻糖的形成掩蓋了葡萄糖和果糖的活性基團，兩者反應活性低于葡萄糖[16]。本研究果糖、葡萄糖質量分數隨著脅迫的加深有所下降，從而促進了淀粉質量分數的增加，雖然差異不顯著，但是調節淀粉合成的SS(Unigene40295)、Glc-1-pa(Unigene38453)、GBE(CL4668.contig3)基因的表達量增加，進一步證明了高溫可能促進胞質蔗糖質量分數的變化，通過ADP-glucose催化促進淀粉的合成[16]。雖然ADP-glucose是否是催化淀粉合成的關鍵酶還存在爭議[16]，但是本研究定量結果顯示：SPS(CL651.contig6)基因隨著高溫脅迫的加深，呈現下降趨勢，這進一步說明了淀粉積累與蔗糖積累之間存在相關性，但是具體機制還需要深入研究。

綜上所述，景寧木蘭在高溫脅迫下，積累糖和淀粉以提升抵抗脅迫能力，且淀粉與蔗糖途徑的關鍵基因表達也反映了景寧木蘭響應高溫脅迫的機制。具體基因的功能驗證還需進一步研究。