杜仲WOX家族基因鑒定及在葉片發育中的表達

劉 俊，李 龍，陳玉龍，陳隨清

（1.河南中醫藥大學 中醫藥科學院 河南省中醫方證信號傳導重點實驗室，河南 鄭州 450046；2.國際竹藤中心國家林業和草原局/北京市共建竹藤科學與技術重點實驗室，北京 100102；3.國際竹藤中心 安徽太平試驗中心，安徽 黃山 245716；4.西北農林科技大學 林學院，陜西 楊凌 712100；5.河南中醫藥大學 藥學院，河南 鄭州 450046）

Wuschel-related homeobox (WOX)是植物特有的新型轉錄因子，屬于Homepbox (HOX)超家族，包含由60～65個氨基酸組成的螺旋-環-螺旋-轉角-螺旋的保守結構域。WOX家族基因分為3個獨立進化支，即現代進化支 (modern clade，WUS)，中間進化支 (intermediate clade)和遠古進化支 (ancient clade)[1?3]，其中WUS是最早發現的WOX家族成員[4]。WOXs蛋白在植物胚胎形成[5]、干細胞維持[6]和花發育[7]等方面發揮重要作用。擬南芥Arabidopsis thaliana中WOX家族有15個成員，分別是AtWUS和AtWOX1～AtWOX14[4]，其中，AtWOX10、AtWOX13和AtWOX14蛋白屬于遠古進化分支，AtWUS和AtWOX1～7等8個蛋白質屬于WUS分支，AtWOX8、AtWOX9、AtWOX11和AtWOX12蛋白屬于中間進化分支。AtWUS在胚珠、花藥和莖尖分生組織中表達，是維持中央分生組織的關鍵基因，AtWOX11和AtWOX12參與新生根器官發生，在頂端分生組織發育階段，AtWUS參與干細胞穩態維持[8]。超表達AtWUS促進棉花Gossypium hirsutum體細胞胚胎發育和器官發生[9]。水稻Oryza sativa中，OsWOX11激活冠根的萌發和生長，過表達OsWOX11可促進雌蕊增加[10]；OsWOX3A參與水稻葉片、小穗、分蘗和側根的發育[11]；在莖頂端分生組織和腋分生組織中OsWOX4正調控干細胞[12]。超表達WOX11 (PeWOX11a和PeWOX11b)或WOX11/12a增加轉基因植株不定根數量[13?14]。在小麥Triticum aestivum中超表達TaWUS影響外花輪狀器官發育，TaWOX9促進轉基因擬南芥根的發育[15]。

WOXs轉錄因子不僅調控植物生長發育，而且參與脅迫響應。在水稻中OsWOX12A和OsWOX12B等基因的表達受干旱、寒冷和鹽脅迫差異調控，超表達OsWOX11通過促進根毛生長發育提高轉基因植株干旱脅迫耐受性[16?17]。84K楊樹Populus alba×P.glandulosa中，干旱脅迫誘導PagWOX11/12a基因強烈表達，促進根系伸長和生物量生長，上游調控因子PagERF35激活PagWOX11/12a表達[18]，PagWOX11/12a通過調控PagCYP736A12 基因表達，調節活性氧 (reactive oxygen species，ROS )清除，提高楊樹耐鹽性[19]。

杜仲Ecommia ulmoides是杜仲科Eucommiaceae杜仲屬Eucommia的落葉喬木，為中國二級保護植物，葉片、樹皮和果皮中富含杜仲膠，是重要的膠用和藥用經濟樹種，具有極高的開發利用價值[20]。杜仲葉片中含有綠原酸、黃酮類、木脂素類、環烯醚萜類、α-亞麻酸等藥用成分，具有抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤、增強免疫力等重要作用[21?22]。鑒于WOX基因在擬南芥、水稻、玉米Zea mays、楊樹、油菜Brassica napus、鐵皮石斛Dendrobium officinale等中的作用，推測WOX家族基因可能在杜仲葉芽的形成和激活過程中起關鍵作用。本研究以杜仲基因組數據為基礎，對杜仲WOX家族基因進行了全基因組鑒定和生物信息學分析，基于轉錄組分析WOX在杜仲葉片不同發育時期以及杜仲膠形成中的表達模式，利用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測杜仲WOX基因(EuWOXs)在‘紫葉’杜仲‘Ziye’葉片發育中的表達水平，以期為EuWOXs功能的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

自西北農林科技大學苗圃(陜西楊凌)，取生長正常長勢一致的2年生‘紫葉’杜仲幼苗的葉芽(莖尖)、生長葉(3 cm長葉片)、幼葉(完全展開的新葉)，用液氮迅速處理，置于?80 ℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 杜仲WOX蛋白(EuWOXs)的鑒定及理化性質分析 擬南芥WOX蛋白序列下載于TAIR數據庫(https://www.arabidopsis.org/index.jsp)，根據Pfam號(PF00046)在杜仲基因組數據庫中篩選出WOX家族基因候選序列，利用美國國立生物技術信息中心 (National Center for Biotechnology Information，NCBI)的保守結構域搜索服務(Conserved Domain Search Service，CD Search)檢測蛋白質保守結構域，篩選出具有完整WOX結構域的蛋白質作為EuWOX家族成員，利用生物信息學方法[23]分析EuWOXs的理化性質。

1.2.2 杜仲WOX家族基因染色體定位及系統進化分析 通過杜仲基因組數據庫搜索WOX基因在染色體上的位置及每條染色體長度，利用MapGene2Chromosome v2 (http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)軟件繪制WOX家族基因染色體定位。利用DNAMAN進行蛋白序列比對，通過Clustal X 1.83對杜仲、擬南芥、毛果楊、水稻和玉米WOXs蛋白進行多序列比對，利用MEGA 6.0鄰接法(neighbor-joining)，重復次數設置為1 000次[24]，構建系統發育樹，根據擬南芥同源基因對EuWOXs蛋白命名。

1.2.3EuWOXs的結構、基序及啟動子分析利用GSDS(http://gsds.gao-lab.org/index.php)軟件分析EuWOXs的內含子和外顯子分布。利用MEME (http://meme-suite.org/)軟件分析EuWOXs基序，參數設置為：any number of Repetitions，maximum number of Motifs=20，minimum width≥6，and maximum width≤50。分離EuWOXs啟動子 (ATG)上游 2 000 bp 序列，利用 Plant CARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/htmL/)分析EuWOXs啟動子順式作用元件。

1.2.4EuWOXs的表達模式分析 從 NCBI的 Short Read Arshive (SRA)數據庫中下載‘秦仲 1 號’‘Qinzhong No.1’葉片不同發育時期(葉芽、初生葉、幼葉、老葉)(版本號：SRP218063)[25]及高產膠杜仲品種‘秦仲2號’‘Qinzhong No.2’、低產膠杜仲品種‘小葉’‘Xiaoye’(版本號：SRP158357)[26]的轉錄組數據，使用每1百萬個映射上的堿基中映射到外顯子的每1千個堿基上的堿基個數(fragments per kilobase million，FPKM)值表示EuWOXs相對表達豐度，取對數 (log2)進行統計分析，利用TBtools工具繪制基因表達圖譜[27]。

使用Trizol(天根DP424)提取RNA，反轉錄成cDNA，通過Primer 3.0軟件設計EuWOXs特異性引物 (引物序列見表 1)，通過 Quant Studio 6(新加坡 Life Technologies公司)，All-in-One SYBR Premix EX TaqTM kit(美國 Gene Copoeia公司)進行實時熒光定量 PCR(RT-qPCR)反應，10 μL 反應體系：2× mix 5.00 μL、正向引物/反向引物各 0.25 μL、cDNA 2.00 μL、ROX 0.20 μL、雙蒸水 2.30 μL。反應程序：95 ℃預變性 5 min，95 ℃ 變性 10 s，60 ℃ 退火 10 s，72 ℃ 延伸 20 s，45 個循環。以UBCE2 為內參基因[26]，通過 2???Ct法對3次生物學重復進行數據分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.5 EuWOXs蛋白互作關系分析 通過 STRING 軟件 (https://string-db.org/)上傳 EuWOXs蛋白質序列，利用擬南芥數據庫，根據擬南芥WOXs蛋白已知互作關系，預測EuWOXs互作蛋白，通過Cytoscape 3.7.0軟件對EuWOXs蛋白質互作信息進行評估和預測[28]。

2 結果與分析

2.1 杜仲WOX家族基因鑒定及其蛋白質理化性質

由表2可知：從杜仲基因組中共鑒定到8個EuWOXs，分布在8條染色體上(圖1)；均含有HD保守結構域，其中EuWOX1序列最長，編碼352個氨基酸，EuWOX13-2序列最短，編碼191個氨基酸。EuWOXs分子量為22.12～40.36 kDa，EuWOX11等電點最小，為5.62，EuWOX4-1等電點最大，為9.04；亞細胞定位預測結果顯示：EuWOXs均定位在細胞核中，均為親水性蛋白。

圖1 EuWOXs 染色體位點Figure 1 Chromosome site of EuWOXs genes

表2 EuWOXs 蛋白質序列特征及亞細胞定位Table 2 Sequence characteristics and subcellular location of E.ulmoides WOX proteins

2.2 EuWOXs的保守結構域

利用DNAMAN軟件對8個EuWOXs及12個擬南芥WOXs蛋白(AtWOXs)保守結構域進行序列分析。結果(圖2)顯示：WOXs蛋白質HD結構域氨基酸及其分布具有顯著的相似性，均包含由60個氨基酸組成的螺旋-環-螺旋-轉角-螺旋，螺旋較環和轉角保守。谷氨酰胺(Q)、亮氨酸(L)和脯氨酸(Pro)是螺旋Ⅰ (Helix Ⅰ)結構域的保守氨基酸，脯氨酸、異亮氨酸(Ile)和亮氨酸是螺旋Ⅱ (Helix Ⅱ)結構域的保守氨基酸，相比之下，螺旋Ⅲ (Helix Ⅲ)結構域最為保守，其中保守氨基酸有天冬酰胺(N)、纈氨酸(V)、色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、谷氨酰胺、天冬酰胺和精氨酸(R)。EAR-like僅存在于EuWOX1、EuWOX2、EuWOX4-1、EuWOX4-2和EuWOX5中，屬于WUS，暗示EuWOXs在進化過程中具有保守性。

圖2 擬南芥和杜仲 WOXs的蛋白質同源結構域序列分析Figure 2 Sequence analysis of WOX proteins homeo domain in A.thaliana and E.ulmoides

2.3 不同物種WOX家族蛋白的系統發育樹

對8個杜仲EuWOXs、15個擬南芥AtWOXs、18個毛果楊Populus trichocarpaWOX蛋白(PotriWOXs)、13個水稻OsWOXs、20個玉米ZmWOXs的蛋白質序列進行多重比對，構建無根系統發育樹。結果如 圖3所示：74個WOXs蛋白共分為3組[遠古進化支、中間進化支和現代進化支(WUS)]，其中遠古進化支含有12個WOXs蛋白，中間進化支含22個WOXs蛋白，現代進化支包含的蛋白數量最多，共有40個。8個EuWOXs中，EuWOX13-1和EuWOX13-2屬于遠古進化支，EuWOX11屬于中間進化支，EuWOX1、EuWOX2、EuWOX5、EuWOX4-1和 EuWOX4-2等 5個蛋白質屬于WUS。進化結果顯示：杜仲與毛果楊親緣關系最近。

圖3 杜仲、擬南芥、毛果楊、水稻和玉米WOXs蛋白系統發育樹Figure 3 WOX proteins phylogenetic trees of E.ulmoides, A.thaliana, P.trichocar, O.sativa and Z.mays

2.4 EuWOXs基因結構及蛋白質的保守結構域

利用GSDS軟件構建EuWOXs基因內含子-外顯子結構圖，結果如圖4顯示：EuWOXs含有1～3個內含子，EuWOX13-2、EuWOX2和EuWOX5基因含有2個外顯子，EuWOX11、EuWOX13-1、EuWOX4-1和EuWOX4-2含有3個外顯子，EuWOX1含有4個外顯子。不同進化分支基因結構差異顯著，同一分支基因結構也存在差異。屬于中間進化支的EuWOX11含有3個外顯子，同屬遠古進化支的EuWOX13-1和EuWOX13-2分別含有3個和2個外顯子，在WUS中，EuWOX2和EuWOX5含有2個外顯子，EuWOX4-1和EuWOX4-2含有3個外顯子，而EuWOX1含有4個外顯子。

圖4 杜仲 WOX 家族基因的結構分析Figure 4 Structural analysis of WOX gene family in E.ulmoides

蛋白質保守基序分析顯示：EuWOXs含有10個保守基序，分別命名為Motif 1～Motif 10 (圖5)，其中Motif 1和Motif 2最為保守，是WOX的核心基序，存在于所有EuWOXs中。Motif 6較為保守，存在于4個EuWOXs蛋白質(EuWOX4-2、EuWOX2、EuWOX1和EuWOX5)中。相同分支EuWOXs含有相似的保守基序，不同分支EuWOXs基序之間存在顯著差異，Motif 4～Motif 10只存在于現代進化分支，Motif 3只在EuWOX13-1和EuWOX13-2蛋白質中存在。

圖5 杜仲 WOX 基因家族保守基序分析Figure 5 Conserved motifs analysis of E.ulmoides WOX gene family

2.5 杜仲 EuWOXs啟動子順式作用元件分析

順式作用元件分析結果(圖6)顯示：EuWOXs啟動子中主要包括脫落酸(ABRE)和水楊酸反應元件(TCA-element)、厭氧響應元件(ARE)、光響應元件(Box 4)及玉米蛋白代謝調節元件(O2-site)。所有順式作用元件中光響應元件最多，達77個，其中Box 4元件有26個，所占比例是34%；G-box和GT1-motif元件均有9個，占比為12%，表明EuWOXs基因表達可能與光合作用有關。EuWOXs共含有46個激素響應元件，32個脅迫響應元件，其中ABRE和ARE元件數量最多，均含有14個，所占比例分別為31%和44%，暗示EuWOXs參與杜仲激素及脅迫響應。此外EuWOXs共含有12個生長發育調控相關元件，其中O2-site有6個，占50%。

圖6 EuWOXs 基因啟動子順式作用元件分析Figure 6 Cis-element analysis of EuWOX genes promoter

2.6 EuWOXs基因表達模式分析

利用‘秦仲1號’葉片不同發育時期轉錄組數據對EuWOXs基因的表達模式進行分析。結果(圖7)可見：EuWOXs在葉片不同發育時期表達豐度存在顯著差異，EuWOX11和EuWOX2在杜仲葉芽、初生葉、幼葉、老葉時期均不表達，EuWOX5僅在葉芽和老葉中低表達，EuWOX13-2在4個時期中的FPKM值均大于20，推測EuWOX13-2參與杜仲葉片的整個發育過程；EuWOX13-1和EuWOX4-1在葉芽中表達豐度最高，隨著葉片發育表達水平逐漸降低，表明EuWOX13-1和EuWOX4-1主要在葉芽中發揮作用；EuWOX1在生長葉中表達量相對較高，其余EuWOXs基因表達豐度較低，FPKM值小于5。

圖7 EuWOXs 在杜仲葉片不同發育階段的表達模式Figure 7 Expression patterns of EuWOXs at different developmental stages in E.ulmoides leaves

利用RT-qPCR檢測EuWOXs在‘紫葉’杜仲葉片不同發育階段(葉芽、生長葉、幼葉)的表達水平。結果(圖8)可見：EuWOX1、EuWOX2、EuWOX4-1、EuWOX5和EuWOX13-2在生長葉中表達量最高，隨著葉片發育表達水平呈先升高后降低趨勢，EuWOX4-2在幼葉中表達量最高，EuWOX13-1在葉芽中表達量最高，隨著葉片發育，表達量逐漸降低，暗示EuWOX13-1在葉片發育的起始階段發揮重要作用。EuWOX1、EuWOX13-1和EuWOX13-2在‘紫葉’杜仲葉片中的表達趨勢與‘秦仲1號’一致。

圖8 杜仲EuWOXs基因在杜仲葉片不同發育時期的表達模式Figure 8 Expression pattern of EuWOX genes in E.ulmoides leaves at different developmental stages

利用‘秦仲2號’和‘小葉’杜仲成熟葉片轉錄組數據檢測EuWOXs的表達模式。由如圖9可見：大部分EuWOXs轉錄水平較低，其中有6個EuWOXs基因幾乎不表達，EuWOX13-2表達水平最高，FPKM值＞40，不同膠含量樣品之間無顯著差異，推測EuWOXs在杜仲膠形成過程中發揮作用較小。

圖9 EuWOXs 在杜仲膠形成中的表達模式Figure 9 Expression patterns of EuWOX genes in the form of Eu-rubber

2.7 EuWOXs蛋白互作網絡預測分析

植物WOXs蛋白由多基因家族編碼，蛋白質之間可能存在相互作用。利用STRING數據庫，構建EuWOXs蛋白相互作用網絡。圖10顯示：該網絡包含21個節點(互作蛋白)和82條邊(相互作用組合)。EuWOX4-1可與20個蛋白質互作，其中包含干細胞分化抑制因子(CLE41和CLE44)，細胞增殖和愈傷組織形成蛋白(CLV1、CLV3和ACT7)，胚胎發育相關蛋白(TPL、BBM和APM1)，維管組織發育蛋白(PXY、HB-8、ATHB-15、MOL和RUL1)，細胞程序化死亡調控因子(LOL1)，參與DNA的復制和延伸(MCM1、POLD2)以及信號轉導蛋白(F14K14)，花藥發育關鍵調控因子(RPK2)，參與DNA的復制植物發育相關轉錄因子GRAS(HAM3和SCL27)等，推測EuWOXs全面參與了杜仲的生長發育。

圖10 EuWOXs 蛋白互作網絡預測Figure 10 Prediction of interaction network between EuWOX proteins

3 討論

WOX蛋白是植物特有的高度保守的一類轉錄因子，廣泛參與植物的生長發育、干細胞維持、組織器官發生和形成等多種生物學過程。到目前為止，WOX家族基因已在多個物種進行了研究報道，如擬南芥中含有15個、毛果楊18個、水稻中有13個、玉米中有20個、毛竹Phyllostachys edulis中存在27個[29]，小麥中有 26個[30]、茶樹Camellia sinensis中包含 18個[31]，黃瓜Cucumissativus中有 11個[3]，陸地棉Gossypium hirsutum中含有 38 個[32]。小麥 (17 Gb)[33]、玉米 (2 300 Mb)[34]和毛竹 (2 021 Mb)[35]基因組大于杜仲 (1.2 Gb)[36]，擬南芥 (164 Mb)[37]、水稻 (441 Mb)[38]和毛果楊 (392.3 Mb)[39]基因組小于杜仲。杜仲WOX數量低于擬南芥、毛果楊、水稻、玉米、小麥和毛竹，表明WOXs基因的豐富程度與基因組大小無關，這可能與基因重復有關。

杜仲基因組中共鑒定出8個EuWOXs，分布在8條染色體上。EuWOXs均為核定位蛋白，在現代進化支(WUS)、中間進化支和遠古進化支分別含有5、1和2個成員，其系統發育模式與擬南芥、水稻、陸地棉等類似[29，31?32]。EuWOXs基因啟動子中含有多種生長發育、激素響應、非生物脅迫以及光周期響應元件。在水稻中，WUS的OsWOX5和中間進化支的OsWOX11、OsWOX12A和OsWOX12B基因表達受生長素、細胞分裂素和赤霉素調節，超表達OsWOX11可提高水稻抗旱性[16?17]。細胞分裂素強烈促進蘋果Malus pumilaWOX1和WOX3基因表達，生長素誘導黃瓜CsWOX1b和CsWOX3基因表達[3]。在擬南芥中，生長素反應因子 5 (AUXIN RESPONSE FACTOR，ARF5)上調AtWOX1 和PRS(AtWOX3)基因的表達，ARF2、ARF3和ARF4抑制AtWOX1和PRS的表達[40]。OsWOX3A參與水稻器官發育、葉片橫向軸伸長、穎花外稃形態發生以及分蘗和側根發育[10]，MtWOX1的同源基因STENOFOLIA是蒺藜苜蓿Medicago truncatula葉片生長和維管組織形成的必須基因[41]，PttWOX4在楊樹形成層中特異表達，PttWOX4a/b RNAi干擾后導致維管形成層寬度縮小，次生生長減弱[42]。推測EuWOXs可能在杜仲生長發育、激素和脅迫響應等生物學過程中發揮重要作用。

WOX家族基因參與葉片發育。屬于中間支的AtWOX9/STIMPY過表達導致擬南芥葉緣波浪化[43]，SlLAM1主要在番茄Solanum lycopersicum葉片、花和果實中表達，SlLAM1缺失導致葉片變窄，次生小葉數量減少[44]，超表達黃瓜CsWOX9導致轉基因擬南芥角果變短，蓮座葉和分枝數目增加[3]。來源于WUS的AtWOX3是擬南芥側托葉發育的必需基因，Atwox1和Atwox3缺失突變體導致葉片和花器官變窄，影響葉片橫向擴張和花瓣融合[45?46]；GhWOX9_At，GhWUSa_At和GhWUSb_Dt主要在棉花幼葉中高量表達[47]。遠古進化分支中的OsWOX13在水稻葉、莖、根維管組織中表現為空間表達調控，在花和發育中的種子中是時間表達調控[48]。在杜仲中，EuWOX13-1在葉芽中表達量最高，隨著葉片發育，轉錄水平逐漸降低，暗示EuWOX13-1主要在杜仲葉片發育的早期階段發揮作用。EuWOX13-2在生長葉中表達量較高，在葉片發育過程中呈現先升高后降低的趨勢。EuWOX13-1和EuWOX13-2是一對重復基因，其表達水平的差異可能與基因結構不同有關，也可能是EuWOX13-1和EuWOX13-2在重復后發生了功能分化。在甘藍型油菜Brassica napus中，BnCWOX13a與BnCWOX13c互為同源基因，然而它們的表達趨勢完全不同[49]，在擬南芥中，AtWOX13在初生根、側根、雌蕊和胚發育中動態表達，而AtWOX13的直系同源基因AtWOX14只在側根形成的早期階段和發育的花藥中特異表達[50]，由此推測EuWOX13-2可能只獲得了EuWOX13-1基因的部分功能，具體功能還需要進一步研究。