高產Monacolin K紅曲霉的誘變選育及其與釀酒酵母共酵培養

沙見宇，裴 歡，劉 曦，閆雪秋

（北京北大維信生物科技有限公司，北京 100094）

紅曲是指以大米為原料，接種紅曲霉經固態發酵而成的紅曲米[1]。現代研究表明，紅曲發酵產物含有莫納克林K、紅曲色素、γ-氨基丁酸、支鏈氨基酸、麥角固醇、酶類活性物質等多種有益成分[2-3]。莫納克林K是紅曲發酵產物中的主要活性成分，莫納克林K以酸型（開環）和內酯型（閉環）兩種形態存在，其中內酯型莫納克林K的穩定性較酸型莫納克林K更高。在酸性條件下，酸型莫納克林K會向內酯型不斷轉化[3]，內酯型莫納克林K具有降血脂、降膽固醇的活性。

羥甲基戊二酰單酰輔酶A（hydroxymethylglutaryl CoA，HMG-CoA）還原酶是人體中膽固醇生物合成限速酶，而莫納克林K可以與HMG-CoA還原酶受體競爭性結合，從而抑制HMG-CoA還原酶活性，進一步減少膽固醇的合成[4-5]。同時，莫納克林K還可以通過提升肝細胞膜上的低密度脂蛋白受體的數量、活性及其親和力，促使膽固醇轉化為膽汁而排出體外，從而降低血漿中的膽固醇含量[6]。

在提高紅曲發酵產物中莫納克林K的方法中，常見的有菌種分離鑒定[7]，發酵工藝優化[8]、誘變育種[9]、基因編輯[10]等方法；還有一些新興的育種技術，如常壓室溫等離子體[11]、氮離子束[12]、高能混合粒子場[13]等。紫外誘變即通過以紫外線照射微生物，促使微生物核酸上的嘌呤和嘧啶堿基生成嘧啶二聚體，從而阻礙堿基之間的正常配對，導致微生物發生突變甚至死亡，提高突變頻率，通過適當的方法篩選育種[14]。共酵培養則是通過將紅曲霉菌與其他菌液混合一起參與發酵，目前已報道的研究表明，紅曲霉菌與多種酵母進行共酵均可提高發酵產物中莫納克林K含量[15-16]。但以往研究中大多只采用一種方法提高莫納克林K產量，對同時采用紫外誘變和共酵的研究報道較少。該研究選用紫外誘變篩選紅曲菌株，結合與釀酒酵母共酵培養的方法，以期進一步提高紅曲發酵產物中莫納克林K含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與試劑

紫色紅曲霉（Monascus purpureus）MY-11：實驗室保藏；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）2.2084：中國普通微生物菌種保藏管理中心；葡萄糖、七水硫酸鎂、無水氯化鈣、磷酸二氫銨、蛋白胨（均為分析純或生化試劑）、體積分數為95%乙醇（分析純）：國藥集團化學試劑公司；大米粉：五常市萬福米業有限公司；土豆：市售；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基：北京陸橋技術股份有限公司；乙腈、三氟乙酸（均為色譜純）：美國Fisher公司；莫納克林K標準品（色譜純）：中國食品藥品檢定研究院；超純水：實驗室自制。

1.1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：取PDA培養基干粉46.0 g，加入1 000 mL 蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌30 min，備用。

液體發酵培養基[17]：葡萄糖80 g/L，蛋白胨10 g/L，NH4H2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl20.1 g/L，以土豆汁溶解上述藥品，121 ℃滅菌20 min。

大米培養基[18]：大米粉38.5%，麩皮7.5%，水50%，葡萄糖2.5%，蛋白胨1.5%，pH值為5，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

ZHWY-2102恒溫培養振蕩器：上海智誠有限公司；LRH-250-HSE恒溫恒濕培養箱：珠江泰宏君儀器設備有限公司；BXM-110VE立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊醫療生物儀器股份生物有限公司；WGL-230B電熱鼓風干燥箱、FW80高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；島津LC-20AT型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日本島津公司；KQ5200DE型超聲波清洗機：昆山合創超聲儀器有限公司；METTLER XPE205DR型電子天平：梅特勒托利多公司；超純水儀：美國PALL公司。

1.3 方法

1.3.1 孢子菌懸液的制備

取一支斜面菌種，加入少量無菌水，用接種環刮下斜面上的孢子，裝入三角瓶中振搖15 min，使孢子充分散開，用帶有4層擦鏡紙漏斗過濾掉菌絲，定容至50 mL，制成孢子菌懸液。

1.3.2 紫外誘變方法[19]

取6份10 mL孢子菌懸液于無菌培養皿中，置于15 W紫外燈下30 cm處，分別照射0、10 s、20 s、30 s、40 s、60 s。取誘變后各照射時間段孢子懸液0.5 mL，稀釋至10-4。取各稀釋液0.1 mL涂布于固體培養基，30 ℃避光培養7 d，記錄平板菌落數，計算誘變致死率，其計算公式如下：

1.3.3 菌株篩選

紫色紅曲霉初篩[20]：觀察平板上長出的菌落，挑取生長速度較快或形態、顏色變化的菌株轉接到PDA培養基30 ℃培養。

紫色紅曲霉復篩：將篩選得到的紅曲霉菌株按照5%（V/V）接種于液態發酵培養基中，30 ℃搖床培養2 d。吸取液體種子于大米培養基中，攪拌混勻，30 ℃培養25 d，得到紅曲。按照1.3.6步驟進行莫納克林K的檢測，篩選莫納克林K含量高的誘變菌株。

1.3.4 遺傳穩定性實驗

將篩選得到的高產莫納克林K的誘變菌株接種到PDA斜面培養基上，連續轉接5代，相同條件下發酵培養，通過HPLC法測定每代菌株發酵液的莫納克林K含量，分析誘變菌株的遺傳穩定性。

1.3.5 共酵培養

將釀酒酵母于12°Bx的麥芽汁中進行活化，28 ℃活化24 h，得到酵母菌液。將誘變菌株接種于液體發酵培養基中，30 ℃振蕩培養48 h，得到紅曲霉菌液。

將酵母菌液和紅曲霉菌液接入大米培養基內，20%（以大米培養基為基準）紅曲菌液體分別與0、1%、2%、3%、4%（109CFU/mL）的酵母菌液進行共酵培養，攪拌混勻，30 ℃培養25 d，得到紅曲。

1.3.6 莫納克林K的測定

取紅曲采用HPLC法進行莫納克林K的檢測。紅曲于90 ℃干燥24 h后，用高能粉碎機粉碎成紅曲粉。檢測紅曲粉中酸型莫納克林K和內酯型莫納克林K的含量[21]。

1.3.7 數據處理與分析

實驗數據用Excel 2016軟件進行整理和統計和分析。

2 結果與分析

2.1 不同紫外照射時間下的致死率

不同紫外照射時間對致死率的影響結果見圖1。對紅曲霉菌MY-11進行紫外誘變，采用致死率來考察紫外線對紅曲霉的損傷作用。為獲得較高的正突變率，方便誘變菌株的篩選，選取致死率在70%～80%的最佳[22]。由圖1可知，紫外誘變劑量達到20 s時，紅曲菌的致死率達到76%，所以確定紫外誘變的最佳照射時間為20 s。

圖1 紫外誘變時間對致死率的影響Fig.1 Effect of UV mutation time on lethality

2.2 產莫納克林K菌株的篩選

以紫色紅曲霉MY-11為出發菌株進行紫外誘變，經菌落形態初篩，獲得紫外誘變菌株8株，編號為M1～M8，分別對其進行固態發酵并測定莫納克林K的含量，檢測其是否高于出發菌株莫納克林K的含量，測定結果見表1。由表1可知，與出發菌株相比，誘變菌株M7、M8的莫納克林K的含量均有較大提高，含量分別達到了12.42 mg/g、12.49 mg/g；相比出發菌株MY-11分別提高了26%、27%，因此選擇誘變菌株M7和M8作為共酵培養的菌種。

表1 紅曲霉MY-11紫外誘變菌株復篩結果Table 1 Rescreening results of UV mutagenesis strains of Monascus MY-11

2.3 誘變菌株M7、M8產莫納克林K的穩定性

單一紫外誘變初篩效果較好，但紫外誘變后的突變菌株性狀具有不穩定性，傳代培養過程中會出現性狀衰退，需要遺傳穩定性試驗進行驗證。對M7和M8分別連續傳代5次，進行固態發酵實驗，并檢測其莫納克林K產量，結果見表2。

表2 紅曲霉誘變菌種的遺傳穩定性Table 2 Genetic stability of mutated Monascus strain

由表2可知，誘變菌株M7、M8傳代5次后，紅曲霉M7、M8傳代培養發酵的莫納克林K含量均有不同程度的下降，紅曲霉M8的衰減幅度明顯高于紅曲霉M7，M7的遺傳穩定性優于M8，與第一代菌株相比，第五代的菌株莫納可林K產量分別降低了27%和39%。可能是因為單一的紫外誘變使得菌株易產生“疲勞效應”，引起菌種的活性代謝物質減少[23]。

2.4 共酵培養對莫納克林K含量的影響

由于單一的紫外誘變方法使得紅曲霉產莫納克林K能力呈現衰退的趨勢，有研究表明，紅曲霉菌與多種酵母進行共酵均可提高發酵產物中莫納克林K含量[15-16]。因此該研究采用與酵母共酵的方法繼續提高紅曲霉誘變菌株產莫納克林K的能力。為探究酵母共酵對莫納克林K產量的影響，以第5代的紫外誘變篩選菌株M7、M8為研究對象，分別與不同添加量酵母菌菌液共酵25 d，測定菌株的莫納克林K產量，結果見表3。

表3 紅曲霉M7、M8分別與酵母固態共酵25 d的莫納克林K含量測定結果Table 3 Determination results of Monaklin K content of solid-state fermentation Monascus strains M7 and M8 with yeast for 25 d

由表3可知，酵母接種量的大小會影響紅曲霉M7發酵的莫納克林K含量。適宜的接種量有利于微生物的生長代謝和次級代謝產物的積累[24-25]。當酵母接種量為3%時，紅曲霉M7發酵的莫納克林K含量最高為9.35 mg/g，相比不加酵母液，提高了2.63%。同樣，當酵母接種量為3%時，紅曲霉M8發酵的莫納克林K含量最高為8.94 mg/g，相比不加酵母液提高16.41%。當接種量小于3%時，莫納克林K的含量較低，推測酵母在固態發酵過程中與紅曲霉共酵，釋放出較少對莫納克林K產量提高有益的誘導因子，不足以使產量顯著提高。當接種量大于3%時，可能是由于引入的水分較多，不利于菌體的生長。可能由于紅曲霉與酵母共酵生長，能夠持續釋放更多對莫納克林K有益的誘導因子，使得含量提高[16]。朱蕊等[16]做過類似的研究，加入酵母共酵使得洛伐他汀的含量可達12.93 mg/g。綜上，添加適量的酵母菌對固態發酵有益，對于紅曲霉M7、M8，加入3%的酵母菌液共酵均能提高莫納克林K產量。

3 結論

為提高紅曲霉固態發酵產莫納克林K能力，加快紅曲霉固態發酵生產莫納克林K工業化進程。該研究以紅曲霉MY-11為原始菌株，經紫外誘變篩選出M7、M8兩株誘變菌株，其莫納克林K含量分別達到了12.42 mg/g、12.49 mg/g；相比原始菌株MY-11分別提高了26%、27%。單一的紫外誘變方法使得紅曲霉產莫納克林K能力呈現衰退的趨勢，將誘變菌株M7、M8分別與釀酒酵母共酵培養25 d，發現加入3%的酵母菌液共酵均能提高莫納克林K產量，對比不加酵母液，分別提高了2.63%、16.41%。總體來說，單一紫外誘變相比共酵在提高菌株產莫納克林K含量上具有較大的優勢，但紫外誘變存在遺傳穩定性不足的缺陷，紫外誘變篩選結合共酵培養方法會提高紅曲中莫納克林K含量。后續研究采用復合誘變、優化誘變菌株的發酵工藝等方法解決遺傳穩定性不足等問題。