響應面法優化五味子蜂蜜酒發酵工藝

郭楠楠，王 璇，李 曉，謝 立

（鄭州科技學院 食品科學與工程學院 鄭州市食品安全快速檢測重點實驗室，河南 鄭州 450064）

蜂蜜營養價值極高，是一種高碳水化合物的食物，其主要成分是果糖、葡萄糖以及約25種低聚糖，同時還含有少量蛋白質、酶、氨基酸、礦物質、微量元素、維生素、芳香化合物和多酚[1]。我國蜂蜜產量位居世界第一[2]，但由于蜂蜜品質低，缺少知名品牌，導致我國蜂蜜出口價格低[3]。開發蜂蜜產品，提升蜂蜜附加值，為人民群眾創產增收，穩固脫貧攻堅成果有著十分重要深遠的意義[4]。蜂蜜酒是蜂蜜加水稀釋經發酵制成，蜂蜜酒中含17種氨基酸和葡萄糖、果糖、維生素A（vitaminA，VA）、VE以及礦物質等，對人體有一定的保健作用[5]。董彩文等[6]以干桂花、蜂蜜為主要原料，制備干桂花蜂蜜酒，其最優發酵工藝條件為糖度28%、酵母接種量0.2%、銨鹽質量濃度0.9 g/L、麥曲添加量9%，在28 ℃發酵6 d。在此發酵條件下，干桂花蜂蜜酒酒精度為16.98%vol。張杰等[7]以黑米、蜂蜜和水為原料，通過單因素試驗和響應面法優化蜂蜜酒的發酵工藝，制得一款酒精度為12.7%vol的蜂蜜酒，酒體協調，呈酒紅色，兼有黑米和蜂蜜特殊風味。

五味子（Schisandra chinensis）是我國著名的傳統中藥材，其果實具有甘、苦、辛、咸和酸五種味道[8]，五味子含有木脂素類、揮發油類等多種化學成分[9]，具有抗炎、護肝保肝功效，可用于咳嗽虛喘、神經和精神疾病、遺精、尿頻、久瀉不止等癥狀[10-11]，鄭春英等[12]利用釀酒酵母發酵北五味子，發酵后的北五味子中4種主要木脂素類成分（五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲、五味子醇甲）的含量均顯著提高。目前，國內已有五味子釀酒的研究報道，劉洋[13]以北五味子、大米為原料，甜酒曲為糖化發酵劑經混合發酵工藝釀制北五味子米酒，并對其發酵工藝條件進行優化。榮軍等[14]以6種不同釀酒酵母發酵制備北五味子酒，發現不同酵母發酵之后的五味子酒的揮發性成分差異較大，這為五味子酒的釀酒酵母的選擇提供了一定的理論參考。五味子釀酒的歷史由來已久，但將其與蜂蜜復配用于釀造蜂蜜酒的研究較少，二者搭配制作的五味子蜂蜜酒可以兼具五味子功效和蜂蜜酒的營養價值。

本研究以五味子和蜂蜜為主要原料制備五味子蜂蜜酒，通過單因素試驗及響應面法優化五味子蜂蜜酒的釀造工藝，并對五味子蜂蜜酒的揮發性風味成分及理化指標進行測定。以期為蜂蜜酒的研究發展提供一定的理論依據，同時將五味子應用于蜂蜜酒的釀造，以期能豐富五味子蜂蜜酒中特殊功能性成分的研究，為后續研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

北五味子干果：產自吉林長白山；多花蜂蜜：北京百花蜂業科技發展股份公司；EXCELLENCETME2F酵母：法國LAMOTHE-ABIET公司。

1.1.2 試劑

檸檬酸（食品級）：河南得立富食品配料有限公司；碳酸鈉（食品級）：扶溝縣味思美食品廠；膨潤土：法國OENOFRANCE公司；氫氧化鈉（分析純）：無錫市亞泰聯合化工有限公司；濃鹽酸（分析純）：洛陽昊華化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）培養基、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（lauryl sulfate tryptose，LST）肉湯培養基、煌綠乳糖膽鹽（brilliant green lactose bile，BGLB）肉湯培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

TRACE1300-TSQ9000氣相色譜-質譜/質譜（gas chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，GC-MS/MS）聯用儀：賽默飛世爾科技有限公司；ES1200-4電子天平：沈陽龍騰電子有限公司；PHB-05便攜式pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；DZKW電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫療儀器廠；GRP-9080型隔水式恒溫培養箱：上海森信實驗儀器有限公司；酒精計：河北省武強滏陽玻璃儀表廠；手持糖度計：北京云華科儀科技有限公司；UV-2800H型紫外可見分光光度計：尤尼科（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 五味子蜂蜜酒的加工工藝流程及操作要點

操作要點：

五味子預處理：選擇無腐爛、無霉變的五味子干果、洗凈晾干，將五味子粉碎成粗顆粒之后過60目篩，便于五味子甲素等有效成分的浸出[15]，然后加水調整五味子含量為1.9%，配置成五味子水溶液。

調整成分：使用蜂蜜調整五味子水溶液的糖度為25%，檸檬酸、碳酸鈉調整五味子蜂蜜混合液的pH值為4.0。

熱處理：在90 ℃條件下保持30 min殺菌，此外，使蜂蜜中轉化酶失活以提高發酵效率[16]。

接種、發酵：將活性干酵母于經熱處理之后的發酵液5 mL中溶解，在30 ℃下保溫活化20～30 min，然后接種到五味子蜂蜜混合液中，接種量為0.16%。發酵溫度控制在26 ℃，發酵期間每天固定時間段測定可溶性固形物含量。當可溶性固形物含量減少緩慢時，即停止發酵。

陳釀：將發酵液置于室溫條件下陳釀10 d。

澄清：提前將膨潤土溶于10倍質量熱水（50 ℃左右）中，靜置膨化4 h。酒液中用量為1 g/L，搖勻，靜置澄清5 d[17]，用殺菌后的多層紗布過濾取上清液。

巴氏殺菌：取澄清后的上清液，在高溫滅菌鍋中保持65 ℃，滅菌30 min，即得五味子蜂蜜酒成品。

1.3.2 五味子蜂蜜酒發酵工藝優化單因素試驗

在參考其他文獻的基礎上[18-23]，固定發酵時間為7 d，設置五味子含量分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，初始可溶性固形物含量分別為16%、20%、24%、28%、32%，酵母接種量分別為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%，初始pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，發酵期間每天固定時間段測定可溶性固形物含量。發酵停止，澄清滅菌后對五味子蜂蜜酒進行感官評分，并測定其酒精度。

1.3.3 五味子蜂蜜酒發酵工藝條件優化響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，以感官評分（Y）為響應值，五味子含量（A）、初始可溶性固形物含量（B）、酵母接種量（C）、初始pH值（D）四個因素為自變量，采用Design-Expert 13.0.1軟件對五味子蜂蜜酒的發酵工藝條件進行優化。五味子蜂蜜酒發酵條件優化試驗因素水平見表1。

表1 發酵條件優化Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test for fermentation process conditions optimization of Schisandra chinensis mead

1.3.4 感官評價

采用感官綜合評分法對五味子蜂蜜酒進行感官評分。根據GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》和QB/T 5475—2020《蜂蜜酒》，制定五味子蜂蜜酒感官評價標準，見表2，滿分為100分，由14名經感官培訓過的同學組成評定小組，對五味子蜂蜜酒的外觀（20分）、香氣（30分）、滋味（40分）和典型性（10分）對五味子蜂蜜酒進行感官評價。

表2 五味子蜂蜜酒感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of Schisandra chinensis mead

1.3.5 分析檢測

可溶性固形物：采用手持糖度計測定；酒精度：參照GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》中的酒精計法；總糖、總酸：分別參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中直接滴定法、電位滴定法。總木脂素含量的測定：采用分光光度法[24]，總多糖含量的測定：采用分光光度法[25]。

香氣成分采用GC-MS/MS分析。氣相色譜條件：柱流量1.0 mL/min；TG-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱溫40 ℃保留3 min，然后以3 ℃/min的升溫速度升至160 ℃保持2 min，以8 ℃/min的升溫速度升至230 ℃保持5min。質譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度250 ℃；傳輸線溫度250 ℃；全掃描模式（掃描范圍30～450 amu）。

菌落總數及大腸菌群的測定：按照GB 4789.2—2022《食品微生物學檢驗菌落總數測定》以及GB 4789.3—2016《食品微生物學檢驗大腸菌群計數》。

1.3.6 數據處理

使用Microsoft office excel 2019、Origin 2021、Design-Expert 13.0.1進行數據處理、圖表制作以及數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 五味子含量對五味子蜂蜜酒品質的影響

五味子含量對五味子蜂蜜酒品質的影響見圖1。

圖1 五味子含量對五味子蜂蜜酒品質的影響Fig.1 Effect of Schisandra chinensis contents on the quality of S.chinensis mead

由圖1可知，隨著五味子含量在1.0%～3.0%范圍內的增加，酒精度呈現上升趨勢，而可溶性固形物含量呈下降的趨勢。當五味子含量在1.0%～2.0%范圍內的增加時，感官評分逐漸增加；當五味子含量為2.0%時，感官評分達到最大值，為86分；當五味子含量＞2.0%時，感官評分逐漸下降。綜合考慮，最適五味子含量為2.0%。

2.1.2 初始可溶性固形物含量對五味子蜂蜜酒品質的影響

初始可溶性固形物含量對五味子蜂蜜酒品質的影響見圖2。

圖2 初始可溶性固形物含量對五味子蜂蜜酒品質的影響Fig.2 Effect of primary soluble solids contents on the quality of S.chinensis mead

由圖2可知，當初始可溶性固形物含量在16%～32%范圍內增加時，可溶性固形物含量逐漸增加。當初始可溶性固形物含量在16%～24%范圍內增加時，感官評分逐漸增加；當初始可溶性固形物含量為24%時，感官評分達到最高值，為83分；當初始可溶性固形物含量＞24%時，感官評分逐漸下降。當初始可溶性固形物含量在16%～28%范圍內增加時，酒精度逐漸增加，但初始可溶性固形物含量為24%、28%時，其酒精度差異不大；當初始可溶性固形物含量＞28%時，酒精度逐漸下降。其原因可能是，初始可溶性固形物含量較低時，產生的酒精度也較低，導致了五味子蜂蜜酒酒體不豐滿，感官評分較低；當初始可溶性固形物含量較高時，發酵液滲透壓較高，會明顯抑制發酵[24]，導致發酵結束后的可溶性固形物含量較高，酒精度較低。較高的殘糖量也會導致酒體甜味過重，影響口感，感官評分較低。此外，也會影響貨架期。綜合考慮，最適初始可溶性固形物含量為24%。

2.1.3 酵母接種量對五味子蜂蜜酒品質的影響

酵母接種量對五味子蜂蜜酒品質的影響見圖3。

圖3 酵母接種量對五味子蜂蜜酒品質的影響Fig.3 Effect of yeast inoculum on the quality of S.chinensis mead

由圖3可知，隨著酵母接種量在0.05%～0.25%范圍內的增加，酒精度逐漸上升，而可溶性固形物含量下降。當酵母接種量在0.05%～0.15%范圍內的增加，感官評分逐漸增加；當酵母接種量為0.15%時，感官評分達到最大值，為84分；當酵母接種量＞0.15%時，感官評分逐漸下降。酵母接種量越高，發酵越徹底，酒精度越高，發酵結束時可溶性固形物含量越低，但過高的酵母接種量會使酒液產生不悅口感，使感官評分降低。綜合考慮，最適酵母接種量為0.15%。

2.1.4 初始pH值對五味子蜂蜜酒品質的影響

初始pH值對五味子蜂蜜酒品質的影響見圖4。

圖4 初始pH值對五味子蜂蜜酒品質的影響Fig.4 Effect of initial pH on the quality of S.chinensis mead

由圖4可知，隨著初始pH值在3.0～4.0范圍內的增加，可溶性固形物含量快速下降，而感官評分與酒精度快速上升；初始pH值為4.0時，可溶性固形物含量為9.2%，感官評分為78分，酒精度為10.4%vol，當初始pH值＞4.0時，可溶性固形物含量下降趨勢趨于穩定，感官評分與酒精度的上升趨勢趨于平穩。其原因可能是，當初始pH值較低時，發酵結束時的可溶性固形物含量較高，酒精度也比較低。酵母生長受到了嚴重的抑制，發酵速度緩慢，不利于風味物質的形成[26]。初始pH值較高時，對雜菌抑制作用減小，容易引起酒液風味變差，品質降低[27]。綜合考慮，最適初始pH值為4.0。

2.2 發酵工藝條件優化響應面試驗

在單因素試驗結果的基礎上，以感官評分（Y）為響應值，五味子含量（A）、初始可溶性固形物含量（B）、酵母接種量（C）和初始pH值（D）4個因素為自變量，采用響應面法進行優化，篩選出五味子蜂蜜酒的最佳發酵工藝條件，響應面試驗設計及結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 發酵工藝條件優化響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface tests for fermentation process conditions optimization

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

對試驗所得數據利用分析軟件Design-Expert 13.0.1進行多元回歸方程擬合，得到感官評分（Y）的二次多項回歸模型方程為：

由表4可知，該模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.359 5＞0.05），說明構建的回歸模型擬合較好。決定系數R2為0.935 1，說明該模型試驗誤差小，擬合程度好，調整決定系數R2adj為0.870 2，表示該模型可以解釋87.02%的響應值變化。變異系數（coefficient of variation，CV）=2.54%＜5.00%，說明模型重現性較好。信噪比=12.872 8＞4，說明該模型很適合五味子蜂蜜酒的預測。由P值可知，一次項A、B，二次項A2、B2、C2、D2對五味子蜂蜜酒感官評分的影響極顯著（P＜0.01）；一次項C、D，交互項AB對五味子蜂蜜酒感官評分的影響顯著（P＜0.05），其他項對五味子蜂蜜酒感官評分的影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，4個因素對五味子蜂蜜酒感官評分的影響主次順序為：五味子含量（A）＞初始可溶性固形物含量（B）＞酵母接種量（C）＞初始pH值（D）。

各因素間交互作用對感官評分影響的響應曲面及等高線見圖5。

圖5 各因素間交互作用對五味子蜂蜜酒感官評分影響的響應面及等高線Fig.5 Responses surface plots and contour lines of effects of interaction of each factors on sensory scores of Schisandrae chinensis mead

由圖5可知，在該模型中，AB曲面較為陡峭，并且等高線呈現出橢圓形，說明其交互作用顯著，固定酵母接種量和pH不變，感官評分隨著五味子含量和初始可溶性固形物的增多呈現先增大后降低的趨勢，存在極值。而AC、AD、CD、BD、BC交互作用不顯著。這與方差分析結果一致。

由Design-Expert 13.0.1軟件預測得出五味子蜂蜜酒最佳發酵工藝條件為：五味子含量1.93%、初始可溶性固形物含量24.77%、酵母接種量0.158%、初始pH值為4.08，感官評分理論值為84.88分。為了便于實際生產操作，將五味子蜂蜜酒發酵生產工藝修正為：五味子含量1.9%、初始可溶性固形物含量25%、酵母接種量0.16%、初始pH值4.0。在此優化條件下進行6次平行驗證試驗，五味子蜂蜜酒的感官評分實際值為84.20分，實際值與預測值相差不大，表明該回歸模型可靠，具備應用價值。

2.3 五味子蜂蜜酒理化及微生物指標檢測結果

對五味子蜂蜜酒理化指標進行測定，其酒精度為11.2%vol，總糖（以葡萄糖計）為24.6 g/L，總酸（以酒石酸計）為6.1 g/L，可溶性固形物含量為8.8%。五味子蜂蜜酒中主要功能成分木脂素總含量為0.062 g/100 g，總多糖含量為0.047 g/100 g；五味子蜂蜜酒的菌落總數為42 CFU/mL，大腸菌群未檢出。

2.4 五味子蜂蜜酒揮發性香氣成分的GC-MS/MS分析

采用氣相色譜-質譜/質譜聯用法分析五味子蜂蜜酒中揮發性香氣物質，檢測結果見表5。

表5 五味子蜂蜜酒揮發性香氣成分GC-MS/MS檢測結果Table 5 Determination results of volatile aroma components in Schisandra chinensis mead analyzed by GC-MS/MS

由表5可知，五味子蜂蜜酒共鑒定出揮發性香氣成分17種，其中酯類6種，醇類7種，烯類3種，醚類1種。其主體風味成分是醇類（75.25%）、烯類（10.48%）、酯類（9.85%）。醇類如乙醇、苯丙醇、橙花叔醇等賦予了酒液突出的酒香與果香[28]；萜烯類物質感官閾值較低，對酒液香氣形成也十分重要[29]；酯類如乙酸乙酯、辛酸乙酯、葵酸乙酯等賦予了酒液獨特而又復雜的水果香味[30]。其中，乙醇相對含量最高，占比34.95%，其次分別為苯丙醇（23.31%）、2-甲基丁醇（12.31%）、D-檸檬烯（7.92%）、己酸乙酯（4.3%）、辛酸乙酯（2.12%）等。

3 結論

本研究以五味子和蜂蜜為主要原料制備五味子蜂蜜酒，以感官評分作為評價指標，通過單因素試驗及響應面試驗確定五味子蜂蜜酒最佳發酵工藝條件為：五味子含量1.9%、初始可溶性固形物含量25%、酵母接種量0.16%、初始pH值4.0。在此優化條件下，五味子蜂蜜酒的感官評分為84.2分，酒精度為11.2%vol，總糖（以葡萄糖計）為24.6 g/L，總酸（以酒石酸計）為6.1 g/L，可溶性固形物含量為8.8%，主要功能性物質木脂素總含量為0.062 g/100 g，總多糖含量為0.047 g/100 g。其主要的香氣物質為乙醇、苯丙醇、2-甲基丁醇、D-檸檬烯和己酸乙酯。五味子蜂蜜酒呈琥珀色，清澈透亮，蜜香、酒香突出，口感濃厚，酒體豐滿，有輕微苦澀感，整體風格突出。本研究通過優化五味子蜂蜜酒發酵工藝條件，為五味子蜂蜜酒的后續生產提供一定的參考意義。