抗尖孢鐮刀菌貝萊斯芽孢桿菌P9培養基及發酵條件優化

劉 瑾，張朝正，趙 華

（天津科技大學 生物工程學院 工業發酵微生物教育部重點實驗室 天津市工業微生物重點實驗室，天津 300457）

鐮刀菌屬（Fusarium），世界十大植物病原真菌之一[2]，其中，尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是引起150多種植物枯萎病和根腐病的一種土傳性病害病原菌，屬于半知菌類鐮刀菌屬真菌[1]。基于尖孢鐮刀菌對作物有嚴重的破壞性，防控尖孢鐮刀菌，對植物枯萎病和根腐病的防治具有非常重要的意義[3]。微生物菌劑以安全綠色、抗病抗逆、改善土壤微生態、提高品質和產量的優勢成為主要的防治手段[4-7]。目前，應用于生物防治的菌株主要為生防真菌、生防細菌、生防放線菌三大類，例如假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、淡紫擬青霉屬（Paecilomyceslilacinus（Thom.）Samson）、叢枝根菌（Arbuscular mycorrhiza）、木霉屬（Trichodermaspp.）等。

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）是由GARCIA R等新命名的一種生防菌[8-9]，其產生的次級代謝產物可以促進植物生長，抑制病原菌，在飼料、醫藥、食品、植物保護、污水處理和生物防控等領域被廣泛研究和應用[10-13]。作為生物防治菌株，貝萊斯芽孢桿菌分泌的某些膠原蛋白類物質與生物膜形成有密切關系，使菌株的拮抗效果更好，植物根際定殖是生防菌株能力的體現[14-17]。目前，已有關于芽孢桿菌發酵條件優化的研究報道，但不同菌株最佳發酵條件存在較大差異。黎燕珊等[18]優化貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）HC-8的發酵培養基及發酵條件，提高了該菌株的發酵產量，增強對尖孢鐮刀菌、煙草疫霉和輪狀鐮刀菌的拮抗效果。楊可等[19]利用響應面法優化貝萊斯芽孢桿菌TSC001的發酵培養基及發酵條件，提高了發酵液的抑菌活性，增強了對黃瓜灰霉病的拮抗效果。貝萊斯芽孢桿菌的發酵液中除了含有少量的發酵代謝物質外，還含有大量培養雜質，其抑菌活性受到培養基中化合物的種類、比例及發酵培養條件參數的影響。因此，對貝萊斯芽孢桿菌的發酵培養基以及發酵條件的優化決定抑菌活性物質含量的多少，可為其鑒定活性物質及分離提純提供研究基礎。

本研究以對尖孢鐮刀菌具有拮抗作用的貝萊斯芽孢桿菌P9為研究對象，以其發酵液的抑菌效果為考察指標，采用單因素試驗及響應面法對其培養基配方和發酵條件進行優化，以期為尖孢鐮刀菌的綠色防控提供理論依據，為微生物農藥的開發提供微生物資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）：天津科技大學菌種保藏中心；貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）P9：由本實驗室提供。

1.1.2 試劑

酵母浸粉、牛肉膏、胰蛋白胨、蛋白胨、氯化鈉、葡萄糖、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化錳、氯化鈣、氯化鈣、可溶性淀粉、果糖、蔗糖、麥芽糖、大豆蛋白胨、瓊脂粉、硫酸銨、硫酸銅、硫酸鋅：青島高科技工業園海博生物技術有限公司。試驗所用試劑均為國產分析純或生化試劑。

1.1.3 培養基

LB液體培養基：酵母浸粉5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L，pH7.0。LB固體培養基：在LB液體培養基中添加瓊脂20.0 g/L，121 ℃滅菌20 min。

基礎發酵培養基：葡萄糖5.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、K2HPO41.4 g/L、KH2PO40.6 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeCl20.5 g/L，pH 7.0，115 ℃滅菌30 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

H1815高速離心機：湘儀離心儀器有限公司；HPX-9162MBE電熱恒溫恒濕培養箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SY.45-NJB牛津杯（6 mm×8 mm×10 mm）：北京先驅威鋒技術開發公司；ME204電子天平：瑞士METTLER TOLEDO公司；DELTA320 pH計：多利斯科學儀器（北京）有限公司；HNY-200B控溫搖床：上海智能分析儀器制造有限公司；YS-40A干熱滅菌箱：天津天宇機電有限公司。

1.3 方法

1.3.1 貝萊斯芽孢桿菌P9生長曲線的測定

取保藏的貝萊斯芽孢桿菌P9于LB液體培養基中，30 ℃、160 r/min條件下培養36 h得到種子液。將貝萊斯芽孢桿菌P9種子液以3%的接種量接種于LB液體培養基，在30 ℃，160 r/min條件下培養36 h，每隔3 h取樣，測定其OD600nm值，繪制貝萊斯芽孢桿菌P9的生長曲線。

1.3.2 貝萊斯芽孢桿菌P9抑菌發酵液及無菌濾液的制備

將貝萊斯芽孢桿菌P9種子液以3%的接種量接種于LB液體培養基，在30 ℃，160 r/min條件下培養72 h后，5 000 r/min離心10 min去除菌體，取上清液過一次性使用無菌濾膜0.22 μm，得無菌發酵濾液。

1.3.3 貝萊斯芽孢桿菌P9抑菌活性的測定

采用牛津杯法測定貝萊斯芽孢桿菌P9發酵液的抑菌活性，在PDA平板活化培養尖孢鐮刀菌，30 ℃條件下培養5 d，使其鋪滿平板，然后將滅菌牛津杯均勻擺放于平板上，吸取200 μL貝萊斯芽孢桿菌P9無菌發酵濾液加入到牛津杯內，30 ℃條件下培養72 h，通過十字交叉法[20]測量抑菌圈直徑。

1.3.4 發酵培養基優化單因素試驗

固定發酵條件為種子液接種量3%（V/V），30 ℃、160 r/min培養72 h。在基礎發酵培養基的基礎上，分別對培養基配方的碳源種類（葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、麥芽糖）及最佳碳源添加量（0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L）、氮源種類（牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、胰蛋白胨、硫酸銨）及最佳氮源添加量（0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L）、無機鹽種類（NaCl、KCl、CaCl2、MnCl2）及無機鹽添加量（0、0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L）[21]進行優化，并測量優化后抑菌圈直徑。

1.3.5 發酵培養基優化響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，以抑菌圈直徑（Y）為響應值，選取3個影響最大的因素可溶性淀粉含量（A）、酵母浸粉含量（B）、氯化錳含量（C），采用Design-Expert10.0.8軟件進行Box-Behnken試驗設計，確定最佳發酵培養基組成[22-25]。響應面試驗設計因素與水平見表1。

表1 發酵培養基優化Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests design for fermentation medium optimization

1.3.6 發酵條件的優化

固定基本發酵條件為：初始pH值為7、接種量3%、發酵溫度30 ℃、轉速160 r/min、發酵時間72 h，以抑菌圈直徑為考察指標，分別考察初始pH值（5、6、7、8、9）、接種量（1.5%、3.0%、4.5%、6.0%）、發酵時間（24 h、48 h、72 h、84 h）、轉速（80 r/min、160 r/min、240 r/min、320 r/min）、發酵溫度（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）對抑菌效果的影響。

2 結果與分析

2.1 貝萊斯芽孢桿菌P9生長曲線的測定

貝萊斯芽孢桿菌P9的生長曲線見圖1。由圖1可知，Bacillus velezensisP9在培養6 h后進入對數生長期，在培養15 h時，進入穩定期，菌體的OD600nm值達到最大，并基本保持穩定，培養26 h后菌體進入衰亡期，OD600nm值迅速下降。因此，確定貝萊斯芽孢桿菌P9最佳轉接時間為9 h。

圖1 貝萊斯芽孢桿菌P9的生長曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus velezensis P9

2.2 培養基成分優化單因素試驗結果

2.2.1 碳源及最佳碳源添加量的確定

碳源對于Bacillus velezensisP9發酵液抑菌性能的影響見圖2。

圖2 碳源種類（a）及可溶性淀粉添加量（b）對菌株P9發酵液抑菌性能的影響Fig.2 Effect of carbon source types(a)and soluble starch addition(b)on bacteriostatic performance of strain P9 fermentation broth

由圖2a可知，不同的碳源對貝萊斯芽孢桿菌P9所產的拮抗物質均有影響，當以蔗糖或果糖作為碳源時，分泌的拮抗物質較少，對尖孢鐮刀菌的抑制能力較低；葡萄糖、麥芽糖作為碳源時，抑菌圈直徑略有提高；而以可溶性淀粉作為碳源時，抑菌圈直徑可達到9.0 mm，究其原因可能是，可溶性淀粉作為遲效碳源，避免了葡萄糖、果糖等單糖作為碳源時所產生的分解代謝阻遏效應[26-28]。因此，確定最佳碳源為可溶性淀粉。由圖2b可知，隨著可溶性淀粉添加量在0～5 g/L范圍內的增加，抑菌圈直徑逐漸增加；當可溶性淀粉添加量達到5 g/L時，抑菌圈直徑達到最大值，為10 mm；當可溶性淀粉添加量＞5 g/L時，抑菌圈直徑開始下降。因此，確定最適可溶性淀粉添加量為5 g/L。

2.2.2 氮源及最佳氮源添加量的確定

氮源對于貝萊斯芽孢桿菌P9發酵液抑菌性能的影響見圖3。

圖3 氮源種類（a）及酵母浸粉添加量（b）對菌株P9發酵液抑菌性能的影響Fig.3 Effect of nitrogen source types(a)and yeast extract addition(b)on bacteriostatic performance of strain P9 fermentation broth

由圖3a可知，以硫酸銨為氮源時，菌株P9的OD600nm值較低，所產的拮抗物質極少，抑菌圈直徑最小；當以胰蛋白胨、牛肉膏、蛋白胨為氮源時，抑菌圈直徑有所增加；酵母浸粉作為氮源時，抑菌圈直徑可達最大值，為9.4 mm。因此，確定最適氮源為酵母浸粉。由圖3b可知，當酵母浸粉添加量在0～5 g/L范圍內增加時，幾乎無抑菌圈產生；當酵母浸粉添加量＞5 g/L，抑菌圈的直徑逐漸增加；當酵母浸粉添加量為15 g/L時，抑菌圈直徑達到最大值，為9.3 mm；當酵母浸粉添加量＞15 g/L時，抑菌圈直徑逐漸減小。因此，確定最適酵母浸粉添加量為15 g/L。

2.2.3 無機鹽種類及最佳無機鹽添加量的確定

無機鹽對于貝萊斯芽孢桿菌P9發酵液抑菌性能的影響見圖4。

圖4 無機鹽種類（a）及MnCl2添加量（b）對菌株P9發酵液抑菌性能的影響Fig.4 Effect of inorganic salts types(a) and MnCl2 addition (b) on bacteriostasis of strain P9 fermentation broth

由圖4a可知，與基礎發酵培養基相比，添加NaCl、KCl、CaCl2、MnCl2均有抑菌效果，但MnCl2在4種無機鹽中效果最明顯，此時抑菌圈直徑達到11.59 mm。由圖4b可知，當MnCl2添加量在1.0 g/L范圍內增加時，抑菌圈直徑逐漸增加，表明MnCl2對菌株分泌拮抗物質具有一定的促進作用；當MnCl2添加量為1.0 g/L時，抑菌圈直徑達到最大值，為15.5 mm；當MnCl2添加量＞1.0 g/L時，抑菌圈直徑逐漸減小，這表明菌株產生的拮抗物質有所抑制。可能是由于低濃度的MnCl2刺激了Bacillus velezensisP9對碳源的利用，使得Bacillus velezensisP9分泌更多的拮抗物質，但是氯化錳添加量過高導致拮抗物質與MnCl2產生反應，拮抗效果逐漸降低[29]。因此，發酵培養基中最佳MnCl2添加量為1.0 g/L。

2.3 發酵培養基成分優化響應面試驗

根據單因素試驗結果，以抑菌圈直徑（Y）為響應值，選取3個對貝萊斯芽孢桿菌P9產拮抗物質影響較大的因素可溶性淀粉含量（A）、酵母浸粉含量（B）、氯化錳（MnCl2）含量（C）進行響應面試驗，Box-Behnken試驗設計結果見表2，方差分析結果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用Design Expert 10.0.8軟件對表2的數據進行多元回歸分析，擬合得到的模型二次多項式方程為：

表2 發酵培養基優化Box-Behnken試驗設計結果及分析Table 2 Results and analysis of Box-Behnken tests design for fermentation medium optimization

由表3可知，該二次回歸模型極顯著（P值＜0.01），失擬項不顯著（P值=0.651 5＞0.05），說明所建立的模型擬合度較好，模型的決定系數R2=0.979 6，調整決定系數R2adj=0.953 5，表明95.35%的響應值變化能由該模型解釋，變異系數（coefficient of variation，CV）為0.77%，說明試驗與模型建立的方程擬合度良好，能用于分析和預測發酵培養基成分優化。由P值可知，一次項A、B、二次項A2、B2、C2對抑菌圈直徑影響極顯著（P＜0.01），一次項C對抑菌圈直徑影響顯著（P＜0.05），其他項影響均不顯著（P＞0.05）。由F值可知，各因素對抑菌圈直徑影響程度為A＞B＞C。

綜合以上試驗結果，獲得發酵培養基為：可溶性淀粉6.769 g/L，酵母浸粉18.088 g/L，氯化錳0.888 g/L。在此最佳發酵培養基條件下，抑菌圈直徑的預測值為12.79 mm。為便于實驗操作，修正發酵培養基為：可溶性淀粉6.8 g/L，酵母浸粉18.1 g/L，氯化錳0.89 g/L。在此優化條件下進行驗證試驗，測得抑菌圈直徑實際值為12.43 mm，基本符合模型預測值，說明該模型準確度良好。

2.4 培養條件的優化

不同培養條件對菌株貝萊斯芽孢桿菌P9發酵液抑菌性能的影響見圖5。

圖5 不同培養條件對菌株P9發酵上清液抑菌活性的影響Fig.5 Effect of different culture conditions on antibacterial performance of strain P9 fermentation supernatant

由圖5a可知，隨著初始pH值在5～7范圍內的升高，抑菌圈直徑逐漸增加；當初始pH值為7時，抑菌圈直徑達到最大值，為11.9 mm；當初始pH值＞7時，抑菌圈直徑下降。究其原因可能是，過高或過低的初始pH值均對菌株產拮抗物質有抑制作用，可能是由于過酸或者過堿的環境影響了菌體的生長及其生命活動。因此，確定最佳的初始pH值為7。

由圖5b可知，隨著接種量在1.5%～4.5%范圍內的增加，抑菌圈逐漸增加；當接種量為4.5%時，抑菌圈直徑為12.6 mm；當接種量＞4.5%時，抑菌圈直徑趨于平緩。因此，確定最佳接種量為4.5%。

由圖5c可知，隨著發酵時間在24～48 h范圍內的增加，發酵液中并未產生抑菌圈，可能是因為菌體處于富集階段，并未產生拮抗物質；隨著發酵時間的延長，抑菌圈直徑逐漸增加，表明發酵液中的拮抗物質正在逐漸積累；發酵72 h后，抑菌圈直徑達到最大值，為14.7 mm，當發酵時間＞72 h，抑菌圈直徑趨于平穩。因此，確定最佳發酵時間為72 h。

由圖5d可知，當轉速在80～240 r/min范圍內的增加，抑菌圈直徑逐漸增加，這是因為轉速提高了發酵培養基中的溶氧量，為菌體生命活動提供了充足的氧氣；當轉速為240 r/min時，抑菌圈直徑達到最大值，為14.9 mm；當轉速＞240 r/min，抑菌圈直徑迅速減小，其原因可能是，過高的轉速影響了菌體的正常生長及生命活動，從而導致發酵液中拮抗物質逐漸減少。因此，確定最佳轉速為240 r/min。

由圖5e可知，隨著發酵溫度在25～30 ℃范圍內的增加，抑菌圈直徑逐漸增加；當發酵溫度為30 ℃時，抑菌圈直徑達到最大值，為15.0 mm；當發酵溫度＞30 ℃，抑菌圈直徑逐漸降低。因此，確定最佳發酵溫度為30 ℃。

3 結論

本研究以抗尖孢鐮刀菌貝萊斯芽孢桿菌P9為試驗菌株，其發酵液對尖孢鐮刀菌的抑菌效果為考察指標，對菌株P9的培養基及發酵條件進行優化。確定其產拮抗物質最適的發酵培養基為：可溶性淀粉6.8 g/L、酵母浸粉18.1 g/L、MnCl20.89 g/L、FeCl20.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L,K2HPO41.4 g/L,KH2PO40.6 g/L，pH 7.0；最佳發酵條件如下：接種量為4.5%，發酵溫度30 ℃，轉速240 r/min，發酵時間72 h。在此優化條件下，抑菌圈直徑可達到15.0 mm左右，比初始抑菌圈直徑（9.0 mm）擴大了1.7倍，為尖孢鐮刀菌的生物防治提供理論基礎。