微熱輔助低溫等離子體殺菌技術對榨菜貯藏期品質劣變的影響

趙 楠，葛黎紅，張愷熹，黃玉立，，侯新磊，梅 源，曾雪晴，王艷麗，彭燈水，顏正財，章建浩

（1.南京農業大學 食品科學技術學院，江蘇 南京 210095；2.四川省農業科學院 農產品加工研究所，四川 成都 610066；3.四川師范大學 生命科學學院，四川 成都 610101；4.吉香居食品股份有限公司，四川 眉山 620039）

榨菜作為世界三大醬菜之一，因其爽脆鮮香的獨特感官品質深受國內外消費者喜愛[1]。榨菜的制作工藝是腌漬發酵的典型代表，干腌過程形成的高滲環境有效抑制了腐敗菌，使得乳酸菌和真菌成為優勢微生物[2-4]。榨菜發酵完成后經包裝進入貯藏銷售環節，在物流過程中，乳酸菌的后發酵作用常引起發酵體系過酸問題，而真菌則會消耗還原糖和有機酸產生大量氣體并形成膜璞，極易引起包裝后產品的脹袋和膜璞腐敗，最終導致產品感官品質與安全屬性的同時劣化[5-6]。因此，開發針對榨菜包裝產品的廣譜性有效殺菌技術對產品規模化生產與擴大化銷售具有重要作用。

發酵蔬菜產業目前常用的殺菌方式是以巴氏殺菌為代表的熱殺菌，輔以防腐劑的添加以達到抑菌目的。但熱強度常常導致榨菜出現質構軟爛、益生性下降等品質問題，添加劑的使用也大大降低了產品的消費者接受度[7]。近年來低溫等離子體殺菌（cold plasma sterilization，CPS）技術的出現為解決以上問題提供了新思路[8]。該技術是通過高壓電場產生的介質阻擋放電效應進行食品冷殺菌的新型方式，具有安全、無污染、熱效應低的特點[9]。CPS應用于發酵蔬菜時，可殺滅包裝泡菜中的產氣真菌，并減少產膜真菌數量，但對乳酸菌的后酸化作用影響較小[10]。同時，放電效應產生的臭氧也在不同程度上加速了產品色澤褐變與暗淡。微熱輔助低溫等離子體技術（mild heating-assisted cold plasma sterilization，MH-CPS）是將微熱與CPS結合，該技術通過采用低于巴氏殺菌的溫度（50～60 ℃）與低溫等離子體結合對食品進行處理，可在強化殺菌效果的同時，弱化放電效應引起的色澤劣化[11-12]。已有研究發現，相比于巴氏殺菌和CPS單獨處理時，微熱輔助介質電場處理對包裝果蔬汁、果蔬干粉、鮮切果蔬制品中大腸桿菌[13]、單增李斯特菌[14]以及蠟樣芽孢桿菌[12]等致病菌具有更高殺菌率，且對產品感官品質的破壞作用更小[15-17]。目前，有關MH-CPS殺菌技術在發酵食品中的應用僅限于發酵乳制品領域，該技術在奶酪殺菌時可有效減緩質地結塊和色澤褐變現象[18-19]。而MH-CPS在發酵蔬菜包裝產品中的殺菌效果及其對產品貯藏過程中品質的影響還不明確。

因此，本研究以MH-CPS處理包裝榨菜樣品，通過與未殺菌（對照）、微熱殺菌（mild-heating strilization，MHS）、CPS、巴氏殺菌樣品作比較，分析榨菜經不同殺菌方式處理后，在貯藏過程中的理化特性、微生物數量、質構色澤品質變化及腐敗進程，以期為開發適用于包裝榨菜產品的高效殺菌方式提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮脫鹽榨菜（食鹽含量為3 g/100 g，總酸含量為0.25 g/100 g）：吉香居食品股份有限公司；平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）培養基、MRS培養基、孟加拉紅瓊脂培養基、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：青島海博生物技術有限公司；其余化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

CPS-I型低溫等離子體滅菌系統：南京潤屹有限公司；2GN-75-K型包裝機：浙江利強包裝科技公司；TAXTPlus質構儀：英國Stable Micro System公司；S210SevenCompactTM型pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 榨菜的制備與殺菌

將榨菜切為8 mm×8 mm×15 mm大小的樣品置于包裝盒中密封，隨機分為五組。第一組不經殺菌處理，記為對照組；第二組采用巴氏殺菌（80 ℃水浴30 min）處理，記為巴氏殺菌組；第三組采用CPS系統進行殺菌，殺菌參數為：電壓140 kV，頻率50 Hz，時間12 min，記為CPS組；第四組采用微熱（55 ℃水浴15 min）殺菌，記為MHS組；第五組采用MH-CPS殺菌，樣品先進行微熱處理再進行CPS處理，記為MH-CPS組。采用高于常規貯藏溫度條件進行加速貯藏實驗，將殺菌后樣品置于37 ℃避光貯藏，在0、2 d、4 d、6 d分別取樣進行指標測定。

1.3.2 理化指標的測定

（1）pH和總酸的測定[8]

取樣品3 g與27 mL去離子水混合、均質，采用pH計測定pH。取樣品10 g與20 mL超純水混合、超聲提取10 min，過濾得上清液采用0.1 mol/L NaOH滴定，以乳酸為標準物質進行計算，結果以g/100 g表示。

（2）還原糖含量的測定[8]

取榨菜樣品10 g與20 mL超純水混合、超聲提取10 min，過濾得上清液，取2 mL上清液與1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸混勻后于沸水中保溫5 min，于波長540 nm處測定吸光度值。以葡萄糖為標準物質繪制標準曲線，按照標準曲線回歸方程進行還原糖含量計算，結果以g/100 g表示。

（3）亞硝酸鹽含量的測定[10]

取切碎5 g樣品與12.5 mL飽和硼砂溶液、480 mL 70 ℃去離子水混合，于沸水浴中提取15 min，冷卻后取上清液與5 mL亞鐵氰化鉀和5 mL乙酸鋅溶液分別混合，過濾得上清液。上清液中先后加入2 mL氨基苯磺酸溶液和1 mL鹽酸萘乙二胺溶液，15 min后于波長538 nm處測定吸光值。以亞硝酸鈉為標準物質繪制標準曲線，按照標準曲線回歸方程進行亞硝酸鹽含量計算，結果以mg/kg表示。

（4）氨基酸態氮含量的測定[10]

取切碎2 g樣品與15 mL超純水混合、超聲提取10 min，過濾得上清液，先加入0.1 mol/L NaOH將其pH調至8.2，而后加入10 mL甲醛，充分混勻后采用0.1 mol/L NaOH將混合物pH滴定至9.2，氨基酸態氮含量計算公式如下：

式中：M為NaOH濃度，mol/L；V為滴定NaOH消耗量，mL；W為樣品質量，g；0.014是代表N元素的毫摩爾分子量，g/mmol。

（5）質構剖面分析[10]

采用質構分析儀，選用P36探頭，在TPA模式下，測前、測試、測后速度分別為1 mm/s、1 mm/s、2 mm/s，壓縮比例50%。記錄儀器反饋的硬度、咀嚼性數據。

1.3.3 微生物指標的測定

細菌、乳酸菌、真菌的計數參照文獻[8]。在無菌條件下，將5 g樣品與25 mL無菌生理鹽水混合、均質，適度稀釋后分別涂布于PCA培養基平板、MRS瓊脂培養基平板和孟加拉紅瓊脂培養基平板上。PCA培養基用于細菌總數計數，培養條件：30 ℃，72 h；MRS瓊脂培養基用于乳酸菌計數，培養條件：30 ℃厭氧，72 h；孟加拉紅瓊脂培養基用于真菌計數，培養條件：（28±2）℃，48 h。產膜真菌計數參照現有方法[8]。挑取孟加拉紅瓊脂培養基平板上的菌落，分別接種于YPD液體培養基上，于（28±2）℃培養48 h后觀察YPD液體培養基表面膜璞產生情況，若YPD液體培養基表面有膜璞漂浮，則判定該菌落為產膜真菌，計入產膜真菌數量。

1.3.4 數據分析

除質構采用8組平行外，其余指標均采用3組平行，數據結果表示為“平均值±標準差”。采用SPSS 26.0軟件分析數據之間的差異顯著性，顯著性分析水平選取P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 不同殺菌方式對榨菜貯藏期色澤及腐敗進程的影響

外觀可直接反映包裝榨菜在貯藏過程中色澤變化及微生物腐敗的進程，經不同殺菌處理的榨菜在貯藏前后色澤變化及腐敗情況結果見圖1。由圖1可知，與對照組相比，剛完成殺菌的榨菜中CPS組、MHS組和MH-CPS組均較好地保持了新鮮榨菜的外青內赭色澤，而巴氏殺菌組略微泛白且失去光澤。貯藏過程使得榨菜色澤褐變，且表面可見白色膜璞，這與產膜真菌大量繁殖有關[6]。在貯藏6 d后，對照組樣品褐變嚴重，膜璞也積累最多，CPS和MHS組均有少量膜璞產生。MH-CPS組和巴氏殺菌組在貯藏完成后仍無膜璞生成，且MH-CPS組在貯藏全程維持了較好的榨菜色澤。這表明MH-CPS組不僅可有效抑制榨菜在貯藏過程中膜璞腐敗的發生，還可在一定程度上緩解色澤褐變。

圖1 經不同殺菌處理的榨菜在貯藏前后的色澤變化及腐敗情況Fig.1 Color changes and spoilage of Zhacai after sterilization by different treatments during storage

2.2 不同殺菌方式對榨菜貯藏期還原糖含量的影響

還原糖是榨菜中微生物的主要碳源物質，不同殺菌處理的榨菜在貯藏過程中的還原糖含量變化見圖2。由圖2可知，榨菜經殺菌處理后，還原糖含量在貯藏期間均逐漸上升，源于微生物水解蔬菜組織多糖產生的還原糖[20]，由于微生物生長受限代謝減弱，還原糖溶出速度大于消耗速度，導致還原糖積累[10，21]。貯藏6 d后MH-CPS組和巴氏殺菌組還原糖含量均較大，說明這兩種殺菌條件下的后發酵和腐敗作用均受到明顯抑制。

圖2 不同殺菌處理對榨菜貯藏期還原糖含量的影響Fig.2 Effect of different sterilization treatments on reducing sugar contents of Zhacai during storage

2.3 不同殺菌方式對榨菜貯藏期總酸和pH的影響

總酸和pH可反映榨菜貯藏期間的后發酵作用，不同殺菌處理的榨菜在貯藏過程中的pH及總酸含量變化見圖3。

圖3 不同殺菌處理對榨菜貯藏期pH（A）和總酸含量（B）的影響Fig.3 Effect of different sterilization treatments on pH (A) and total acid contents (B) of Zhacai during storage

由圖3可知，在貯藏過程中，對照組pH高于其他組，MHS組樣品在貯藏期間略有上升。而CPS、MH-CPS組、巴氏殺菌組榨菜在貯藏期pH無明顯變化。這與對照組總酸含量在貯藏前期顯著下降的情況相對應。這可能是由于膜璞腐敗真菌消耗有機酸，導致總酸下降而pH上升[22]。殺菌后樣品在貯藏后總酸均有所增加，說明后發酵作用維持了包裝榨菜在貯藏過程的酸度狀態。在貯藏6 d時，CPS、MHS組、MH-CPS組、巴氏殺菌組的總酸含量分別增加了16%、19%、26%和8%。根據總酸和pH結果可知，微熱與CPS單獨或聯合處理均有助于維持榨菜的酸性環境。

2.4 不同殺菌方式對榨菜貯藏期微生物數量的影響

不同殺菌處理的榨菜在貯藏過程中的菌落數量變化見圖4。

圖4 不同殺菌處理對榨菜貯藏期細菌（A）、乳酸菌（B）、真菌（C）和產膜真菌（D）數量的影響Fig.4 Effect of different sterilization treatments on bacteria (A),lactic acid bacteria (B),fungi (C) and film-producing fungi (D) of Zhacai during storage

由圖4可知，榨菜貯藏期間細菌和乳酸菌數量無明顯差別，說明乳酸菌是樣品中的主要細菌。MHS和CPS單獨處理均對細菌和乳酸菌無明顯減菌作用。MH-CPS處理使得起始細菌和乳酸菌數量分別降低了1.9 lg（CFU/g）和1.6 lg（CFU/g），在貯藏期間細菌和乳酸菌繼續減少，最終細菌和乳酸菌數量分別比未殺菌榨菜低2.8 lg（CFU/g）和2.6 lg（CFU/g）。這得益于CPS的后殺菌效應，即在貯藏過程中，放電介質產生的氣體繼續殺滅微生物[23]。巴氏殺菌的即時殺菌效應主要表現在將初始菌數量大幅度削減了3.9 lg（CFU/g），但對乳酸菌的繁殖代謝影響不大，因而乳酸菌數量在貯藏2 d后迅速上升。對于真菌，微熱或CPS處理殺菌效果有限，很難完全殺滅真菌。研究顯示CPS單獨處理對泡蘿卜中乳酸菌破壞作用不大，而對產氣真菌具有較好殺菌效果[10]，與本研究結果不同，說明CPS的殺菌效果因產品而異。對照組榨菜在貯藏期間有大量產膜真菌繁殖，各殺菌方式均實現了貯藏全程無產膜真菌生長的殺菌作用，但CPS、MHS和巴氏殺菌均無法有效抑制細菌和乳酸菌的增殖。MH-CPS組實現了貯藏全程無真菌狀態，同時有效抑制細菌和乳酸菌的增殖，達到了比巴氏殺菌更佳的效果。

2.5 不同殺菌方式對榨菜貯藏期質構品質的影響

榨菜硬度與咀嚼性的同時下降表現為易碎、無嚼勁的不良感官體驗。不同殺菌處理的榨菜在貯藏過程中的硬度和咀嚼性數量變化見圖5。

圖5 不同殺菌處理對榨菜貯藏期硬度（A）和咀嚼性（B）的影響Fig.5 Effect of different sterilization treatments on hardness (A) and chewiness (B) of Zhacai during storage

由圖5可知，隨著貯藏時間延長，硬度和咀嚼性都隨之下降，巴氏殺菌組榨菜在貯藏后質構劣化最為嚴重，可能是由于熱效應下細胞壁果膠溶出，引起植物組織機械強度下降[24]。MHS或CPS單獨處理也可減緩質構劣化，兩者結合可實現最佳的質構提升效果，貯藏6 d后榨菜硬度和咀嚼性比巴氏殺菌組分別提升了34%和44%。在蔬菜發酵過程中，一方面，真菌產生的酶類可降解植物組織化學組分；另一方面，內生菌將侵入植物細胞內部，直接形成物理性破壞，這些過程均可導致質構軟爛[25]。研究表明CPS處理可通過殺菌鈍酶作用提升鮮切果蔬的質構品質[26]。微熱作用可在不溶解細胞壁果膠的前提下，鈍化細胞壁降解酶類，從而維持植物組織完整度[24]。對物理性與化學性破壞的多效抑制作用使得MH-CPS處理法表現出了更佳的質構改善效果。

2.6 不同殺菌方式對榨菜貯藏期亞硝酸鹽含量的影響

亞硝酸鹽是榨菜中常見的食品安全危害因素，不同殺菌處理的榨菜在貯藏過程中的亞硝酸鹽和氨基酸態氮含量變化見圖6。

圖6 不同殺菌處理對榨菜貯藏期亞硝酸鹽含量（A）和氨基酸態氮含量（B）的影響Fig.6 Effect of different sterilization treatments on nitrite contents (A)and amino nitrogen contents (B) of Zhacai during storage

由圖6A可知，對照組亞硝酸鹽含量在貯藏6 d后較初始值增加了1.84倍。CPS組亞硝酸鹽在貯藏結束時增加了29%，高于其他組，這可能是由于CPS放電過程產生的氮氧化物為亞硝酸鹽生成提供了原料[10]。MHS組、MH-CPS組和巴氏殺菌組的亞硝酸鹽含量在整個貯藏過程中無明顯變化。氨基酸態氮是亞硝酸鹽的前體物質，由蛋白降解產生，可指示亞硝酸鹽的潛在生成風險。由圖6B可知，巴氏殺菌組和MH-CPS組氨基態氮含量在整個貯藏進程中無明顯變化，其他組均增長20%～30%。由于真菌是發酵蔬菜中產生蛋白酶的主要微生物[27]，MH-CPS以及巴氏殺菌對氨基態氮積累的抑制也與其對真菌的有效殺滅作用有關。

3 結論

相較于CPS和MHS處理，MH-CPS表現出了更優越的殺菌效果，可完全殺滅榨菜中的真菌尤其是產膜真菌，并大幅度降低細菌和乳酸菌數量，有效減緩產品的膜璞腐敗現象，在穩定理化性質的同時，抑制亞硝酸鹽和氨基態氮積累；與巴氏殺菌的熱處理破壞作用相比，MH-CPS還具有減緩榨菜硬度、咀嚼性劣化并保持色澤的優勢。因此，MH-CPS處理發酵蔬菜具有改善貯藏穩定性的潛力。