谷物牛奶復合發酵乳的發酵條件優化及貯存品質分析

朱 玲，趙 寧，張 杰

（鄭州科技學院 食品科學與工程學院，河南 鄭州 450064）

黑米屬于糯米類，顏色呈黑色或褐色，其營養豐富，其粒型有“粳、秈”2種，粒質包含非糯性和糯性[1-2]。黑米具有降低膽固醇，預防心腦血管疾病，健脾開胃，促進兒童骨骼增長、大腦發育等功效[3-4]。小米是一種無麩質、營養豐富的全谷物食品，含有多種維生素、礦物質和高水平的蛋白質[5]。黑玉米又稱為黑糯玉米、紫玉米，含有豐富的蛋白質、維生素、花青素，具有良好的抗氧化作用和抗癌的功效[6-7]。牛奶富含鈣、優質蛋白質和維生素，適量攝入能提高人的健康水平[8]。

風味發酵乳是以牛奶為主要原料，通過滅菌冷卻后添加乳酸菌發酵劑，添加或不添加谷物、果蔬等，經恒溫發酵制得一種發酵乳制品[9-10]。其中，谷物發酵乳中含有較多的益生菌、膳食纖維、B族維生素，能優化腸道菌群，對腸道疾病、便秘具有良好的預防和治療作用[11-12]，對于平衡膳食具有不可代替的作用。已有以谷物為原料制作功能性發酵飲料，如大麥發酵乳、玉米發酵乳、小麥發酵乳以及多種谷物發酵乳[13]。蔣雅馨等[14]以糜米、玉米碎、大米為主要原料，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為發酵劑，確定了谷物乳酸菌發酵飲料的最佳制備工藝和配方。閆麗麗等[15]以糜米為原料，以2株乳酸菌作為發酵菌株，確定了糜米乳酸菌發酵飲料的預處理條件和發酵工藝，該產品可在4 ℃保存28 d。陳娟等[16]以燕麥、黑米、糙米為原材料，經過超微粉碎、液化、糖化接種混合發酵劑，確定了谷物發酵飲料的生產工藝和配方。然而，國內外研究開發的谷物發酵產品多以谷物與發酵劑進行發酵，營養較單一，因此，開發不同風味的谷物發酵乳對豐富乳制品的營養價值具有重要意義。

本研究以谷物黑米、小米、黑玉米與牛奶為主要原料，制備谷物牛奶復合發酵乳，采用單因素試驗及響應面試驗對其發酵工藝條件進行優化，對其品質進行評價，并確定產品保質期，旨在為谷物類和乳類農產品的深加工提供理論依據和數據支持，豐富乳品市場開辟新的途徑，滿足人們對酸乳產品口味多樣化和營養健康的需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米、小米、黑玉米、白砂糖、牛奶：市售；酸奶發酵劑：昆山佰生優生物科技有限公司；純凈水：華潤怡寶飲料有限公司；羧甲基纖維素鈉（carboxyl methyl cellulose，CMC）（分析純）：孟州市華興生物化工有限責任公司；MRS培養基、MC培養基：青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

HH·BII·421-BS型電熱恒溫培養箱：上海躍進醫療機械廠；KDN-08B（05B）型定氮儀：上海洪紀儀器設備有限公司；YX-280A型高壓滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；FSH-2A型均質機：寧波新芝科技股份有限公司；DJ12B-A10型九陽破壁機：杭州九陽豆業有限公司；WFF-26A食品發酵箱：廣州市泓鋒食品機械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 谷物牛奶復合發酵乳加工工藝流程及操作要點

操作要點：

谷物預處理：黑米、小米、黑玉米去雜質、淘洗，控干谷物表面水分。

打漿：黑米、小米、黑玉米按質量比1∶1∶1，放入破壁機中，按照料液比1∶15（g∶mL）加純凈水，在料液保持微沸下打漿20 min，冷卻至40 ℃左右。

均質：將0.4%CMC與6%白砂糖混合均勻后溶解于純牛奶中[17-18]，并與20%谷物漿液混合均勻，置于均質機中，在15 MPa、65 ℃條件下均質。

滅菌：混合物料于85 ℃條件下殺菌20 min，冷卻至40 ℃[19]。

發酵、攪拌：接種0.4%酸奶發酵劑[20]，在42 ℃條件下發酵6 h[21]，待發酵罐內發酵乳呈凝固的非流體狀態，發酵完成，在無菌條件下用玻璃棒破乳攪拌均勻。

灌裝、后熟：無菌環境下，灌裝至無菌玻璃包裝容器中，封蓋，于2～4 ℃條件下，后熟10 h[22]，即得谷物牛奶復合發酵乳。

1.3.2 谷物牛奶復合發酵乳發酵條件優化單因素試驗

固定基本條件為：以1 000 g純牛奶為基準稱取其他原料或輔料，CMC添加量為0.4%、發酵劑添加量為0.4%，白砂糖添加量為6%，谷物漿添加量為20%，在42 ℃下發酵6 h。采用單因素輪換法分別考察料水比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL））、發酵劑添加量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）、發酵溫度（38 ℃、40 ℃、42 ℃、44 ℃、46 ℃）、發酵時間（5 h、6 h、7 h、8 h、9 h）、白砂糖添加量（5%、6%、7%、8%、9%）、谷物漿添加量（10%、20%、30%、40%、50%）對谷物牛奶復合發酵乳感官評分及酸度的影響。

1.3.3 谷物牛奶復合發酵乳發酵條件優化響應面試驗

以單因素試驗結果為依據，選取對結果影響較大的因素發酵劑添加量（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）、料水比（D）為自變量，以感官評分為響應值（Y），進行響應面試驗設計，采用4因素3水平的Box-Behnken試驗對谷物牛奶復合發酵乳的發酵條件進行優化，試驗設計因素與水平表1。

表1 發酵條件優化響應面試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization

1.3.4 谷物牛奶復合發酵乳的感官評價

依據GB 19302—2010《食品安全國家標準發酵乳》[9]和相關文獻[23-24]，制定谷物牛奶復合發酵乳的感官評價標準，具體評價標準見表2，邀請10位專業人員從氣味、色澤、滋味及組織狀態對谷物牛奶復合發酵乳進行感官評價，滿分為100分。

表2 谷物牛奶復合發酵乳感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of grain-milk compound fermented milk

1.3.5 谷物牛奶復合發酵乳產品貯存期間的品質變化

1.3.6 分析檢測

（1）理化指標測定

pH 值的測定：采用pH 計；酸度的測定：按照GB 5009.239—2016《食品安全國家標準食品酸度的測定》[25]，蛋白質含量的測定：按照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》[26]；黏度的測定：采用旋轉式黏度計[27-28]。

持水力的測定：取10 g樣品，將樣品離心20 min，將乳清倒出來后稱其質量，計算持水力，其計算公式如下：

花青素含量的測定：用pH示差法[32]測定谷物牛奶復合發酵乳在發酵前后花青素含量的變化，計算花青素含量，其計算公式如下：

式中：ΔA表示谷物復合發酵飲料提取液中花青素的總吸光度值；A520nm表示樣品在波長520 nm處測得的吸光度值，A700nm表示樣品在波長700 nm處測得的吸光度值，DF表示樣品稀釋倍數；M表示矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質量為449.2 g/mol；ε表示矢車菊素-3-葡萄糖苷的吸光系數為26 900 L/（mol·cm）；L表示光程長度為1 cm[33]；Wt表示產品的質量，g；V表示最終體積，mL。

（2）微生物指標測定

④基礎工作薄弱，難以滿足防汛抗洪需求。嫩江、松花江、黑龍江流域防汛基礎工作相對落后，一定程度上影響防汛抗洪工作。仍有重點城市缺乏超標準洪水防御方案，近年制定的一些調度方案、防洪預案的科學性、實用性和可操作性不強。防汛物資儲備普遍不足，抗洪搶險專業隊伍建設滯后，難以滿足流域性大洪水抗洪搶險需求。

菌落總數的檢測：按照GB/T 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》的平板菌落計數法[29]；大腸菌群的檢測：按照GB/T 4789.3—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》[30]；乳酸菌落數的測定：按照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌活菌數測定》[31]。

1.3.7 數據處理

利用SPSS26.0軟件和Origin8.0對數據進行處理，同時利用Design Expert 10.0.3對試驗進行設計并進行數據建模處理。

2 結果與分析

2.1 發酵工藝優化單因素試驗結果

2.1.1 料水比的確定

料水比對谷物牛奶復合發酵乳感官評分和酸度的影響見圖1。

由圖1可知，隨著料水比在1∶5～1∶25（g∶mL）范圍內變化，酸度變化不明顯。當料水比在1∶5、1∶10、1∶15（g∶mL）范圍內時，感官評分逐漸增加；當料水比為1∶15（g∶mL）時，感官評分達到最大值，為84分；當料水比為1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL）時，感官評分逐漸下降。因此，最適料水比為1∶15（g∶mL）。

圖1 料水比對谷物牛奶復合發酵乳感官評分和酸度的影響Fig.1 Effect of solid and water ratio on sensory quality and acidity of grain-milk compound fermented milk

2.1.2 發酵劑添加量的確定

酸奶發酵劑的添加量對谷物牛奶復合發酵乳感官評分和酸度的影響見圖2。

圖2 酸奶發酵劑添加量對谷物牛奶復合發酵乳感官評分和酸度的影響Fig.2 Effect of yogurt starter addition on sensory quality and acidity of grain-milk compound fermented milk

由圖2可知，隨著酸奶發酵劑添加量在0.2%～0.6%范圍內的增加，酸度上升。當發酵劑添加量在0.2%～0.4%范圍內增加，感官評分逐漸增加；當酸奶發酵劑添加量為0.4%時，感官評分達到最大值，為85分；當酸奶發酵劑添加量＞0.4%時，感官評分逐漸下降。當酸奶發酵劑添加量＜0.4%時，產品發酵狀態不佳，風味產生不足；當酸奶發酵劑添加量為0.4%時，感官評分最高，產品口感細膩，酸甜適中，組織狀態均勻；當酸奶發酵劑添加量＞0.4%時，產品酸味明顯，口感不協調，出現分層和乳清析出現象[34]。因此，最適發酵劑添加量為0.4%。

2.1.3 發酵溫度的確定

發酵溫度對谷物牛奶復合發酵乳感官評分和酸度的影響見圖3。由圖3可知，隨著發酵溫度在38～46 ℃范圍內的升高，酸度呈上升趨勢。當發酵溫度在38～42 ℃范圍內的增加，感官評分逐漸增加；當發酵溫度為42 ℃時，感官評分達到最大值，為88分；當發酵溫度高于42 ℃時，感官評分逐漸下降。發酵溫度偏低，產品的發酵風味不足，凝乳狀態較差；當發酵溫度達到42 ℃時，組織狀態細膩，酸甜適口，凝乳狀態較好；當發酵溫度高于44 ℃時，部分乳酸菌因為溫度過高失活，發酵風味不足。因此，最適發酵溫度為42 ℃。

圖3 發酵溫度對谷物牛奶復合發酵乳感官品質和酸度的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on sensory quality and acidity of grain-milk compound fermented milk

2.1.4 發酵時間的確定

發酵時間對谷物牛奶復合發酵乳感官品質和酸度的影響見圖4。由圖4可知，隨著發酵時間在5～9 h范圍內的增加，酸度呈上升趨勢。隨著發酵時間在5～6 h范圍內的增加，感官評分呈上升趨勢；當發酵時間為6 h時，感官評分達到最大值，為85分；當發酵時間＞6 h時，感官評分呈下降趨勢。當發酵時間過短，乳酸菌發酵產酸及風味不足，口感較甜；當發酵時間為6 h時，谷物牛奶復合發酵乳酸甜可口，發酵風味突出；當發酵時間過長，酸味明顯，同時有異味產生。因此，最適發酵時間為6 h。

圖4 發酵時間對谷物牛奶復合發酵乳品質和酸度的影響Fig.4 Effect of fermentation time on sensory quality and acidity of grain-milk compound fermented milk

2.1.5 白砂糖添加量的確定

白砂糖添加量對谷物牛奶復合發酵乳感官評分和酸度的影響見圖5。由圖5可知，隨著白砂糖添加量在5%～9%范圍內的增加，酸度呈緩慢上升趨勢。當白砂糖添加量在5%～6%時，谷物牛奶復合發酵乳感官評分逐漸增加；當白砂糖添加量為6%時，感官評分最高，為85分，谷物牛奶復合發酵乳產酸甜可口，黏稠度適中，口感細膩；當白砂糖添加量＞6%時，感官評分有所下降。因此，最適白砂糖添加量為6%。

圖5 白砂糖添加量對谷物牛奶復合發酵乳感官品質和酸度的影響Fig.5 Effect of sugar addition on sensory quality and acidity of grain-milk compound fermented milk

2.1.6 谷物漿添加量的確定

谷物漿添加量對谷物牛奶復合發酵乳感官評分和酸度的影響見圖6。由圖6可知，隨著谷物漿添加量在10%～50%范圍內的增加，酸度呈上升趨勢。當谷物漿添加量在10%～20%范圍內增加時，感官評分逐漸增加；當谷物漿添加量為20%時，感官評分最高，為88分；當谷物漿添加量＞20%時，感官評分逐漸下降。谷物漿添加量＜20%時，谷物自然香氣不明顯，色澤較淺；谷物漿添加量為20%時，谷物牛奶復合發酵乳色澤呈淡紫色，口感細膩適口，組織狀態均勻；當谷物漿添加量＞20%時，口感稍酸，組織狀態不均勻，產品稍稀薄。因此，最適谷物漿添加量為20%。

圖6 谷物漿添加量對谷物牛奶復合發酵乳感官品質和酸度的影響Fig.6 Effect of grain pulp addition on sensory quality and acidity of grain-milk compound fermented milk

2.2 發酵工藝優化響應面試驗

2.2.1 響應面試驗結果與方差分析

在單因素試驗的基礎上，固定白砂糖添加量為6%，谷物漿添加量為20%，選擇發酵劑添加量（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）、料水比（D）為自變量，以感官評分為（Y）為響應值，進行4因素3水平的響應面試驗設計，試驗設計及結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 發酵工藝優化響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation process optimization

利用Design Expert 10.0.3軟件對表3結果進行回歸擬合，建立二次多項式回歸方程為：Y=89.58+1.06A+2.59B+1.70C+1.10D+1.00AB-0.57AC-1.40AD-1.98BC+2.05BD-2.15CD-4.01A2-4.91B2-6.95C2-7.32D2。

由表4可知，該模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.056 8＞0.05），表明該回歸模型合理且模型擬合度高，回歸方程的決定系數R2=0.966 2，調整決定系數R2adj=0.932 3。可見，該模型中93.23%的感官評分變化來自自變量A、B、C和D，該模型可以很好地反映試驗真實值，因此該方程可以用于試驗結果的分析。由P值可知，一次項B、C、交互項CD、二次項A2、B2、C2和D2對谷物牛奶復合發酵乳的感官評分影響極顯著（P＜0.01）。一次項A、D、交互項BC、BD對谷物牛奶復合發酵乳的感官評分影響顯著（P＜0.05），交互項AB、AC和AD對谷物牛奶復合發酵乳的感官評分影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，影響感官評分的因素順序為：發酵溫度（B）＞發酵時間（C）＞料水比（D）＞發酵劑添加量（A）。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

2.2.2 響應面分析

各因素間交互作用對谷物牛奶復合發酵乳感官評分影響的響應曲面及等高線見圖7。

3D曲面較為直觀地反映了各因素之間的交互作用對感官評分的影響，3D曲面越陡峭、傾斜度越高，表明因素間的交互作用對響應值影響越大[35]。由圖7可知，當發酵劑添加量（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）、料水比（D）兩兩交互時，對產品感官評分均有影響，BC、BD、CD的響應曲面較陡峭，且等高線圖呈橢圓形，表明交互作用較為顯著，這與方差分析結果一致。

圖7 各因素間交互作用對感官評分影響的響應曲面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on sensory score

由Design Expert 10.0.3軟件預測谷物牛奶復合發酵乳最佳發酵工藝條件為：發酵溫度42.49 ℃、發酵時間6.10 h、料水比1∶15.40（g∶mL）、發酵劑添加量0.55%、白砂糖添加量6%，感官評分預測值為90.115 7分。為便于實際生產操作，將發酵工藝條件修正為：發酵溫度42 ℃，發酵時間6 h，料水比1∶15（g∶mL），發酵劑添加量0.55%，白砂糖添加量6%。在此優化發酵工藝下進行3次平行驗證試驗，感官評分實際值為93分，與預測值相差不大，表明響應面優化的工藝條件可行。

2.3 谷物牛奶復合發酵乳理化指標和微生物檢測結果

谷物牛奶復合發酵乳的理化和微生物指標見表5。

表5 谷物牛奶復合發酵乳的理化指標和微生物指標Table 5 Physicochemical and microbiological indexes of grain-milk compound fermented milk

由表5可知，產品的理化和微生物指標均符合GB 19302—2010《食品安全國家標準發酵乳》中風味發酵乳標準要求；發酵前花青素含量為7.68 mg/L，發酵后花青素含量為5.33 mg/L，減少了30%。

2.4 谷物牛奶復合發酵乳貯存期間品質的變化和保質期的確定

發酵乳的理想pH值在4.0～4.6之間[36]。谷物牛奶復合發酵乳在貯存期內品質的變化見圖8。

圖8 谷物牛奶復合發酵乳貯存期內pH、酸度（a）與持水力、感官評分和乳酸菌活菌數（b）的變化Fig.8 Change of pH,acidity (a) and water retention,sensory scores,and number of viable lactic acid bacteria (b) during the storage of grain-milk compound fermented milk

由圖8（a）可知，隨著貯存天數在0～25 d內的延長，pH值逐漸下降，而酸度逐漸增加。當貯存時間為22 d時，pH值為4.15，酸度為90.9°T，谷物牛奶復合發酵乳口感細膩，酸甜基本協調，組織狀態均勻。在23～25 d貯存期內，隨著pH值的下降，口感稍酸，酸甜不協調，有少量乳清析出。

由圖8（b）可知，在產品貯存期間，持水力呈緩慢下降趨勢，產品貯存第22天時，持水力＞90%，具有良好的持水能力；乳酸菌活菌數在第3天稍有增加，之后呈下降趨勢，第25天時產品的乳酸菌活菌數降至4.5×107CFU/mL，仍符合國家標準（≥1×106CFU/mL）規定[9]；感官評分呈緩慢下降趨勢，貯存第22天，產品感官評分開始下降。綜合考慮，為保證產品品質，保質期為21 d。

3 結論

谷物小米、黑米、黑玉米與牛奶為主要原料制備谷物牛奶復合發酵乳，通過單因素試驗和響應面試驗獲得其最佳發酵工藝條件為：谷物與水按照料水比1∶15（g∶mL）打漿，以牛奶質量為基準，谷物漿添加量20%，發酵劑添加量0.55%、白砂糖添加量6%，在42 ℃條件下發酵6 h。在此優化條件下，谷物牛奶復合發酵乳的感官評分為93分，pH值為4.57，酸度為81.8 °T，持水力為95%，黏度為11.5（Pa·s），蛋白質含量為3.32 g/100 g，花青素含量為5.33 mg/L。該產品營養較為全面，且富含花青素，產品保質期為21 d。本產品的開發為谷物類和乳類農產品的深加工以及豐富乳品市場開辟了新的途徑。