中藥材對清香型白酒主要釀造微生物及風味物質(zhì)的影響

江 威，李 強，唐 潔，林 斌，朱麗萍，李 群，陳申習

（勁牌有限公司 勁牌研究院 中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435100）

中藥材制曲具有悠久的歷史，在北魏時期的著作《齊民要術》中便有“制曲入藥”的記載，中藥入曲是我國古代釀酒技術的一大創(chuàng)舉[1]，一直沿用至今。如董酒在其大小曲中加入百余種中藥材進行發(fā)酵，形成了獨特的董香型風格白酒[2-3]，邛崍米曲中也加入了72味中藥材[4]。中藥制曲能夠提升酒曲質(zhì)量進而提升原酒質(zhì)量。雷學俊等[5]發(fā)現(xiàn)，黨參、紅景天、白芍的添加對米曲糖化力和液化力的提高具有明顯的促進作用。吳志等[6]在制曲過程中添加3%的石菖蒲、生地黃、白術等藥材的醇提液發(fā)現(xiàn)，添加中草藥酒曲的發(fā)酵力、糖化力、總微生物數(shù)量得到大幅提高。除此之外，中藥制曲還能夠提升白酒的風味。李保國等[7]研究發(fā)現(xiàn)，加入薄荷能夠提升酒的風味物質(zhì)含量。吳瓊燕[8]在桂皮藥曲中檢測到更多的香氣成分。許必晏[9]確定18種促進釀造微生物生長的中藥材，制曲后釀造的清香型白酒質(zhì)量得到提升，且降低雜醇油的效果較好。

清香型白酒清香純正，柔和協(xié)調(diào)，可以與中藥活性物質(zhì)風味相融合，是制作配制酒和藥酒重要基酒之一。根據(jù)勁牌有限公司保健酒中藥材配方及相關研究報道[5-13]發(fā)現(xiàn)，茴香、薄荷、桂皮、陳皮、丁香、甘草具有提升白酒風味作用，茯苓、杏仁、人參、丹參、梔子、川芎、當歸具有保健功能，紅景天、白芍、地黃、白術、桑葉、辣蓼、黃芪能夠提升酒曲性能，這些中藥材具有提升原酒質(zhì)量的潛能。而釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）和米根霉（Rhizopus oryzae）是清香型酒曲中的主要釀造微生物[14-15]，分別具有提高出酒率、高產(chǎn)酯、高糖化力的性能。因此，探究清香型酒曲中中藥材的添加對清香型白酒風味及原酒質(zhì)量的提升具有重要意義，但中藥材的添加對發(fā)酵微生物的生長是否有影響是判斷其能否加入酒曲的前提條件，但目前中藥材對清香型白酒功能微生物生長及品質(zhì)的影響缺乏研究。

本研究采用微生物培養(yǎng)的方法分別探究20種中藥材對清香型白酒中主要發(fā)酵微生物釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y1、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y29和米根霉（Rhizopus oryzae）G1生長的影響，在綠衣觀音土曲中添加中藥材，模擬清香型白酒工藝進行固態(tài)發(fā)酵小試實驗，對糖化醅中的微生物數(shù)量進行分析，通過氣相色譜（gas chromatography，GC）儀對小試酒樣中的乙酸乙酯、乳酸乙酯、雜醇油含量進行檢測，以期明確中藥材的添加對清香型白酒質(zhì)量的影響，驗證中藥材在清香型酒曲中添加的可行性，為后續(xù)制曲中添加中藥材提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

綠衣觀音土曲：勁牌公司毛鋪制曲車間；20種中藥材：勁牌有限公司購于各產(chǎn)地的道地藥材。釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）Y1、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y29、米根霉（Rhizopus oryzae）G1：勁牌有限公司勁牌研究院微生物研究室。

1.1.2 試劑

制霉素（分析純）：華北制藥股份有限公司；葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、瓊脂、氯化鈉（均為分析純或生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇（色譜純）：美國SAFC Biosciences公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

孟加拉紅培養(yǎng)基：海博生物技術有限公司。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、瓊脂20 g，溶解在1 L蒸餾水中，pH 7.0左右，115 ℃滅菌30 min，冷卻至40 ℃后加入終質(zhì)量濃度0.3 g/L的制霉素。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母提取物10 g，溶解在1 L蒸餾水中，115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-75S蒸汽滅菌鍋、SPX-100B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司；BCM-1600A潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；WFJ可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；Agilent 7890A型氣相色譜（GC）儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母活化液及米根霉麩皮種的制備

酵母活化液的制備：將菌株Y1和Y29的甘油管保存液接種于YPD培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，經(jīng)10 mL無菌水試管梯度稀釋至10-5，取10-5梯度稀釋液200 μL均勻涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基中，于30 ℃培養(yǎng)2 d后，對酵母菌進行計數(shù)，獲得酵母活化液。

米根霉麩皮種的制備：于100 g麩皮中加入80 mL蒸餾水，115 ℃滅菌30 min，用接種環(huán)從菌株G1保藏斜面中取出菌絲，接入麩皮中，30 ℃培養(yǎng)3 d后，將培養(yǎng)好的G1麩皮種取出放入托盤，在40 ℃烘箱中烘干24 h，常溫下密封保藏備用。

1.3.2 中藥材培養(yǎng)基的制備

分別稱取20種中藥材（桂皮、茴香、杏仁、甘草、當歸、川芎、辣蓼、陳皮、茯苓、薄荷、人參、白術、梔子、桑葉、黃芪、白芍、丹參、地黃、丁香、紅景天）20 g，清洗藥材表面污垢后，置于清水中浸泡30 min后，加入約400 mL水小火煮沸1 h至200 mL容器中趁熱過濾，4 ℃冷藏備用。以制備藥汁替代相應的無菌水，配制成含10 g/L藥汁的孟加拉紅培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基。

1.3.3 中藥材對微生物生長的影響

以不添加藥汁的孟加拉紅培養(yǎng)基為對照，將4～5個大小均勻的米根霉G1麩皮種接種在孟加拉紅培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)48 h，通過與對照比較菌落大小、菌絲蔓延情況及菌絲茂密程度，考察中藥材是否對米根霉的生長有影響。將酵母活化液稀釋至10-5，取200 μL的酵母Y1活化液（約1.2×108CFU/mL）、酵母Y29活化液（約1.0×108CFU/mL）均勻涂布于含藥汁孟加拉紅培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，對酵母菌落進行計數(shù)。通過與對照比較微生物數(shù)量及菌落直徑，考察中藥材對釀酒酵母Y1和異常威克漢姆酵母Y29生長的影響[16]。

1.3.4 清香型白酒的小試生產(chǎn)及試驗設計

在實驗室水平模擬清香型白酒生產(chǎn)工藝[17]。稱取適量糯高粱于65 ℃熱水中浸泡過夜，115 ℃蒸糧10 min，65 ℃水中燜糧5 min，111 ℃復蒸10 min。將熟糧1 kg攤晾至30 ℃左右，對照組加入5.0 g綠衣觀音土曲，實驗組加入5.0 g綠衣觀音土曲和1.0 g中藥材（丁香和紅景天添加量為熟糧的0.05%，即0.5 g），酒曲和熟糧均勻翻拌后于30 ℃糖化24 h。500 g糖化醅與500 g滅菌酒糟進行混合，30 ℃發(fā)酵7 d后，取酒醅小火慢蒸收集前100 mL酒樣。

1.3.5 中藥材對糖化醅中微生物的影響

在無菌條件下，取10 g糖化醅于90 mL無菌水中，置于150 r/min搖床，30 ℃活化30 min，再經(jīng)10 mL無菌水試管將菌懸液梯度稀釋至10-4，取10-4梯度稀釋液200 μL均勻涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基中，酵母和霉菌在30 ℃下培養(yǎng)2 d，同時取10-4梯度稀釋液200 μL均勻涂布于LB培養(yǎng)基中，細菌在37 ℃下培養(yǎng)1～2 d至單菌落長出，采用菌落記號方式對單菌落進行計數(shù)[17]，測量4～6個菌落直徑，并取平均值。

1.3.6 中藥材對清香型白酒原酒風味物質(zhì)的影響

采用氣相色譜法檢測酒樣中乙酸乙酯、乳酸乙酯、雜醇油含量[18]。

酒樣預處理：準確移取酒樣1 mL于2 mL樣品瓶中，加入10 μL內(nèi)標（叔戊醇質(zhì)量濃度為17 028.1 mg/L，乙酸正戊酯質(zhì)量濃度為16 864.0 mg/L，2-乙基己醇質(zhì)量濃度為12 104.2 mg/L），蓋上瓶蓋，搖勻。

氣相色譜條件：載氣為高純氮氣（N2），純度為99.999%，進樣口溫度250 ℃，分流比30∶1；流速為1.0 mL/min，升溫程序為初始溫度35 ℃，保持1 min，以3 ℃/min升至70 ℃，再以3.5 ℃/min升至190 ℃，保持25 min；檢測器為氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID），溫度260 ℃；尾吹氣流速25 mL/min，氫氣（H2）流速30 mL/min，空氣流速350 mL/min。

定性與定量：采用保留時間定性及內(nèi)標法定量。

1.3.7 出酒率的計算

出酒率的計算參考文獻[19]，在20 ℃條件下，先將樣品實際酒精度折算酒精度為55時的比值，再計算乙醇質(zhì)量，其與投糧量百分比值表示出酒率，出酒率計算數(shù)學式如下：

式中：0.92003為20℃條件下，乙醇體積分數(shù)為55%的原酒密度，g/mL；100為接酒體積，mL；225為投糧質(zhì)量，g。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL2019進行數(shù)據(jù)處理，采用Origin 9.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 中藥材對清香型白酒中主要釀酒微生物生長的影響

2.1.1 中藥材對釀酒酵母Y1和Y29生長的影響

20種中藥材對釀酒酵母Y1和Y29的數(shù)量及菌落直徑的影響見表1。

由表1可知，添加桂皮、茯苓、白芍、丁香、紅景天藥汁的培養(yǎng)基中，菌株Y1菌落直徑均＜2 mm，其中，質(zhì)量濃度為10 g/L的丁香和紅景天藥汁對菌株Y1的大小抑制作用最明顯，菌落直徑僅0.6 mm。上述藥材對菌落數(shù)量沒有較大影響，說明上述藥材成分對菌株Y1的生長速度起到一定的抑制作用。而添加了茴香、杏仁、甘草、陳皮、梔子、桑葉、黃芪的孟加拉紅培養(yǎng)基中，菌株Y1的菌落直徑相較于對照大，菌落直徑在3.0～4.0 mm，增長了50%～100%，說明上述藥材對釀酒酵母Y1的生長具有促進作用，其藥材中成分能夠被釀酒酵母Y1所利用，促進其增殖。薄荷、杏仁、桂皮的添加對菌株Y1的數(shù)量增長有促進作用，其中添加薄荷使菌株Y1的增長量達到18.72%，白術的添加對菌株Y1的菌落數(shù)量有抑制作用，其余6種藥材對菌株Y1的生長沒有明顯的影響。菌株Y1是清香型白酒酒曲中重要的產(chǎn)醇菌株，茴香、杏仁、甘草等中藥材對菌株Y1的生長具有促進作用，應用于酒曲則有望進一步提升酒曲的發(fā)酵力。

表1 中藥材對釀酒酵母Y1和異常威克漢姆酵母Y29生長的影響Table 1 Effect of Chinese medicinal materials on the growth of Saccharomyces cerevisiae Y1 and Wickerhamomyces anomalus Y29

由表1亦可知，添加了紅景天和白芍的培養(yǎng)基中，菌株Y29的菌落直徑較對照小，均＜2 mm，說明其菌落生長速度慢，其中，白芍僅抑制菌落直徑大小，對菌落數(shù)量沒有明顯影響。質(zhì)量濃度為10 g/L的丁香汁完全抑制了菌株Y29的生長，平板中未見菌落長出。添加了茴香、杏仁、甘草、辣蓼、陳皮、人參、白術、梔子、桑葉、地黃的培養(yǎng)基中，菌株Y29菌落的直徑大于對照，菌落直徑在2.6～5.6 mm，其中，甘草和杏仁對菌落直徑的促進作用最明顯，分別達到4.0 mm和5.6 mm，說明甘草和杏仁中存在對菌株Y29生長有益的成分。添加桂皮、陳皮、茯苓、薄荷、人參、白術、梔子、黃芪的培養(yǎng)基中菌落數(shù)量少許增加，薄荷對菌株Y29的增殖也起到一定的促進作用，其菌落數(shù)量增長了23.28%。清香型白酒中以乙酸乙酯為主的酯類物質(zhì)含量是白酒質(zhì)量的重要指標之一，而菌株Y29是主要的酯化酶產(chǎn)生菌株，茴香、杏仁、甘草等中藥有助于Y29的生長，在后期應用于酒曲中，具有提升原酒酯類風味物質(zhì)的潛力。

2.1.2 中藥材對米根霉G1生長的影響

20種中藥材對米根霉G1生長的影響見圖1。由圖1可知，質(zhì)量濃度為10 g/L的丁香和紅景天汁對米根霉的生長具有明顯的抑制作用，且丁香的抑制作用更強，主要表現(xiàn)為菌株G1的菌落較小或菌絲稀疏。茯苓汁對米根霉的生長也具有抑制作用，主要表現(xiàn)為菌落比對照小，但菌絲比對照更長且濃密。20種藥材中對米根霉G1生長具有促進作用的中藥材有桂皮、杏仁、甘草、辣蓼、薄荷、人參、白術、桑葉、黃芪、白芍、丹參、地黃，主要表現(xiàn)為菌絲較蔓延、菌落較大、菌絲較長且相對更加濃密，說明上述藥材對米根霉G1的生長具有促進作用，從而提升與糖化作用相關的酶類含量。將其添加到酒曲中，可促進糖化過程中淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖，進而提高酒曲的糖化力。

圖1 中藥材對米根霉G1生長的影響Fig.1 Effect of Chinese medicinal materials on the growth of Rhizopus oryzae G1

由上述分析可知，丁香和紅景天對菌株Y1、Y29和G1均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，這與丁香中存在丁香酚以及紅景天中富含紅景天甙有關[20-21]，而中藥材中富含糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素等，也是其他中藥材對微生物增殖抑制不明顯或促進生長的原因[22]。除丁香和紅景天外，其他中藥材可用于白酒的發(fā)酵過程中，丁香和紅景天則需探究最佳添加量，以便于為后續(xù)兩種中藥材在清香型白酒釀造中的添加量提供參考。

2.2 紅景天和丁香質(zhì)量濃度對清香型白酒中主要釀酒微生物生長的影響

不同丁香質(zhì)量濃度對菌株Y1、Y29和G1生長的影響見圖2。由圖2可知，隨著丁香質(zhì)量濃度的減小，對3種微生物的生長的抑制能力減弱，當丁香汁的質(zhì)量濃度為0.5 g/L時，對酵母的菌落數(shù)量和米根霉的菌落大小、菌絲長度都有一定的促進作用，因此，培養(yǎng)基中的丁香汁最適質(zhì)量濃度為0.5 g/L。

圖2 丁香汁質(zhì)量濃度對菌株Y1、Y29和G1生長的影響Fig.2 Effect of mass concentration of clove juice on the growth of strains Y1,Y29 and G1

紅景天汁質(zhì)量濃度對菌株Y1、Y29和G1生長的影響見圖3。由圖3可知，紅景天汁的質(zhì)量濃度越低，對3種微生物的抑制效果越小，當質(zhì)量濃度為1 g/L時，紅景天對釀酒酵母Y1和異常威克漢姆酵母Y29的生長沒有明顯的影響，但對米根霉生長具有一定的抑制作用。當質(zhì)量濃度為0.5 g/L時，紅景天汁對兩種酵母沒有明顯的抑制作用，且能促進米根霉菌絲生長。因此，培養(yǎng)基中的紅景天汁的最適添加量為0.5 g/L。

圖3 紅景天汁質(zhì)量濃度對菌株Y1、Y29和G1生長的影響Fig.3 Effect of mass concentration of Rhodiola rosea juice on the growth of strains Y1、Y29 and G1

2.3 中藥材對清香型白酒糖化醅微生物的影響

20種中藥材對糖化醅中微生物數(shù)量的影響見圖4。由圖4可知，大部分中藥材的加入對細菌、酵母和霉菌的數(shù)量均有一定的促進作用。其中，除添加了茯苓和白術的糖化酒醅中細菌數(shù)量分別下降2.08%和4.41%外，其余藥材的加入均對細菌生長有較明顯的促進作用，其中，川芎、甘草、當歸、地黃對細菌生長的促進作用最明顯，細菌數(shù)量分別增加了143.03%、127.55%、96.21%和90.79%。各中藥材對酵母和霉菌生長具有一定促進作用，其中，辣蓼、杏仁和甘草對酵母的菌落數(shù)增加幅度較高，分別增加47.69%、43.07%和40.00%。人參、杏仁和桑葉則能顯著增加糖化醅中霉菌的數(shù)量，分別增加73.47%、32.65%和32.57%。總體來看，杏仁、甘草、當歸、川芎、地黃、陳皮、辣蓼、黃芪、人參、桑葉、桂皮、茴香和薄荷對3種微生物的生長均具有一定的促進作用。

圖4 中藥材對糖化酒醅中細菌（a）、酵母（b）及霉菌（c）數(shù)量的影響Fig.4 Effect of Chinese medicinal materials on the number of bacteria (a),yeast (b) and mold (c) in saccharified grains

2.4 中藥材對清香型白酒質(zhì)量的影響

乙酸乙酯、乳酸乙酯、雜醇油是表征清香型白酒中質(zhì)量的主要色譜指標[23-26]。20種中藥材對乙酸乙酯、乳酸乙酯、雜醇油的影響見圖5。由圖5a可知，9種中藥材（桂皮、茴香、杏仁、當歸、川芎、辣蓼、陳皮、桑葉、黃芪）可增加乙酸乙酯含量，其中茴香、陳皮和杏仁分別使乙酸乙酯含量增加32.44%、17.79%和15.09%；由圖5b可知，8種中藥材（桂皮、茴香、杏仁、甘草、當歸、人參、白術、桑葉）可以增加乳酸乙酯含量，杏仁、茴香、桂皮和白術分別使乳酸乙酯含量增加45.14%、42.82%、38.41%和22.56%；由圖5c可知，10種中藥材（甘草、川芎、茯苓、薄荷、人參、白術、梔子、桑葉、黃芪、白芍）可以降低雜醇油含量，其中，茯苓、黃芪和人參在降低雜醇油含量方面作用較明顯，分別降低了9.23%、7.35%和6.14%。由圖5d可知，5種中藥材（甘草、當歸、川芎、辣蓼、陳皮）對出酒率具有少許提升，其中當歸和川芎分別提升4.49%和3.45%，茯苓、人參、白術、薄荷則分別降低了7.51%、5.87%、4.49%和4.40%的出酒率。

圖5 20種中藥材對清香型白酒中乙酸乙酯（a）、乳酸乙酯（b）、雜醇油（c）及出酒率（d）的影響Fig.5 Effect of 20 Chinese medicinal materials on ethyl acetate (a),ethyl lactate (b),fusel oil (c) and liquor yield (d) in light-flavor Baijiu

3 結論

本研究探究了20種中藥材對清香型白酒主要微生物生長和原酒質(zhì)量的影響，結果顯示，大部分藥材對釀酒微生物的生長具有一定的促進作用，丁香和紅景天則對微生物的生長具有較明顯的抑制作用，其藥汁添加質(zhì)量濃度應控制在0.5 g/L左右。20種藥材中，杏仁、甘草和當歸等中藥材具有促進釀造微生物增殖的作用；杏仁、茴香、當歸和桂皮對原酒具有較好的提高乙酸乙酯和乳酸乙酯的效果，而茯苓、黃芪和人參則具有較好的降低雜醇油的效果。由于不同的藥材其作用不同，在實際生產(chǎn)中應結合不同的酒質(zhì)提升需求，設置不同的中藥材添加種類以及添加比例，在避免中藥材帶來的負面影響的基礎上提升清香型白酒酒質(zhì)。