不同品種高粱釀造清香型白酒的香味物質差異及其與理化品質的相關性

劉茂柯，田新惠，劉成元，景曉衛，馬 超，王思思，倪先林，張星宇，唐玉明

（1.四川省農業科學院 水稻高粱研究所，四川 德陽 618000；2.四川省瀘州市釀酒科學研究所，四川 瀘州 646100；3.四川省農業科學院 生物技術核技術研究所，四川 成都 610066；4.四川華宇瑞得科技有限公司，四川 德陽 618221；5.四川廣漢金雁酒業有限公司，四川 德陽 618302；6.國家高粱改良中心四川分中心，四川 瀘州 646100）

高粱[Sorghum bicolor（L.）Moench]是禾本科高粱屬作物，是釀造中國白酒的主要原料[1]。以往研究顯示，不同品種高粱可能因理化成分（支鏈淀粉、單寧、脂肪等）含量的不同而導致白酒香味物質的組成出現差異，影響酒質。如WU Q等[2]將釀酒酵母接種到高粱浸提液中，發現發酵液的醇、酯含量與高粱的脂肪和單寧含量呈負相關（P＜0.05）。通過模擬釀造試驗，有研究發現當高粱單寧含量＜1.94%時，其含量與酒體乙酸乙酯、辛酸乙酯的含量呈正相關，與乳酸乙酯呈負相關（P＜0.05）[3]。然而，目前針對不同高粱釀造酒質差異的解析主要依賴實驗室發酵實驗進行[4-8]，大生產條件下的酒質差異及其與理化品質的關系還未被充分揭示[9-13]，導致白酒企業在選擇釀酒原料時無據可依，也阻礙了對白酒發酵機制的深入認識。

清香型白酒是中國白酒的主要香型之一，其釀造周期較短、工藝相對簡單[14]，是評價原料釀酒效果的理想模型。本研究以四川酒類企業廣泛應用的3種高粱為材料，揭示它們釀造清香型白酒的香味物質差異及其與理化品質的關系，以期為優質釀酒高粱的選育改良及其推廣應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瀘州紅1號高粱（粗蛋白9.38%、粗脂肪3.37%、粗淀粉73.00%、單寧1.70%、支鏈淀粉93.00%）和金糯梁1號高粱（粗蛋白9.70%、粗脂肪3.54%、粗淀粉74.23%、單寧1.31%、支鏈淀粉92.40%）：由本研究所選育而成；澳洲AZ高粱（粗蛋白11.19%、粗脂肪4.96%、粗淀粉78.42%、單寧0.48%、支鏈淀粉81.22%）：由開展釀酒試驗的酒廠提供。

內標以及香味物質的標準品（均為色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司；高粱理化成分分析所需的常規理化試劑：生工生物工程（上海）股份有限公司；釀造試驗所用的小曲（發酵劑）：四川省彭州華西曲藥廠。

1.2 儀器與設備

Clarus 500氣相色譜（gas chromatography，GC）儀配有火焰離子化檢測器（flame ionization detector，FID）：美國PerkinElmer 公司；CP-Wax 57 CB色譜柱（50 m×0.25 mm×0.2 μm，酸性）：美國Agilent公司；XPR205D5/AC電子分析天平：瑞士Mettler Toledo公司；HH-M8恒溫水浴鍋：江蘇新春蘭科學儀器有限公司；H03-B磁力攪拌器：上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高粱理化成分分析

粗蛋白、粗脂肪、粗淀粉、支鏈淀粉和單寧含量：參照文獻[15]的方法測定。

1.3.2 酒樣發酵

清香型白酒釀造試驗在四川省瀘州市的某兩個酒廠（LHK、JGB）同時進行。在LHK酒廠，除澳洲AZ用3個地缸發酵外，另兩種高粱為6個地缸；在JGB酒廠，每種高粱用3個地缸發酵。每個地缸投入高粱、小曲和糠殼的質量分別為800 kg、4 kg和64 kg。各酒廠的釀造生產由同一批工人操作，發酵期7 d。發酵結束后，每個地缸取出的酒醅分為2甑蒸餾。蒸餾結束后，將每甑酒樣混合后取100 mL混合酒樣供試，共24份酒樣。

1.3.3 酒樣香味物質分析

用無菌蒸餾水將酒樣的酒精度稀釋為60.5%vol后，采用氣相色譜儀檢測香味物質的含量，用2-甲基-2-丁醇、乙酸戊酯和2-乙基丁酸作內標進行定量，色譜反應條件參見文獻[16]。

1.3.4 酒樣感官評價

由瀘州老窖、金雁酒業等白酒企業的7名國家級酒質評委對酒樣進行感官品評，描述酒樣的總體風味特征。

1.3.5 數據統計

采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和雙因素置換多元方差分析（Two-way PERMANOVA）揭示酒樣香味物質的結構組成及其差異；利用曼特爾檢驗（Mantel test）揭示香味物質和高粱理化成分的Pearson相關性，香味物質和理化成分的矩陣分別用Bray-Curtis 和Euclidean 距離表征。以上分析通過PAST 3軟件[17]完成。采用偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）篩查不同品種高粱酒樣的差異香味物質，篩查標準：變量權重值（variableimportantinprojection，VIP）≥1且含量倍數變化（fold change，FC）≥1.2 或≤0.83。PLS-DA和韋恩（Venn）分析通過R軟件完成。酒樣香味物質含量的單因素方差分析、高粱理化成分和香味物質含量的Pearson相關性分析以及多元線性回歸分析（進入法）均由SPSS 20.0完成。圖片制作通過GraphPad Prism（8.0）完成。

2 結果與分析

2.1 酒樣香味物質的含量差異

白酒香味物質以醇、醛、酸、酯為主，其組成決定酒質的優劣[18]。由表1可知，3種高粱酒樣中不同香味物質的含量差異在不同酒廠的表現形式有一定差異。澳洲AZ高粱酒樣的酯、醛、酸類物質含量在兩個酒廠均處于較低水平；不同之處包括多個方面，如澳洲AZ酒樣的醇類含量在JGB酒廠顯著高于瀘州紅1號和金糯粱1號，在LHK酒廠卻顯著低于金糯粱1號（P＜0.05）。

表1 不同品種高粱釀造酒樣的揮發性香味物質含量Table 1 Flavor compound contents of Baijiu samples brewed from different sorghum varieties

2.2 酒樣香味物質的結構差異

由圖1可知，3種高粱酒樣檢測出36種香味物質，包括8種醇、9種酸、6種醛、11種酯和2種酮類。3種高粱酒樣在LHK酒廠均以乙酸乙酯、3-甲基丁醛和異丁醇為主，在JGB酒廠的優勢香味物質有差異，如金糯粱1號酒樣以乙酸乙酯、3-甲基丁醛和乙酸為主，瀘州紅以乙酸乙酯、亞油酸乙酯和3-甲基丁醛為主，澳洲AZ酒樣則以乙酸乙酯、亞油酸乙酯和異丁醇為主。

圖1 不同品種高粱釀造酒樣香味物質的結構組成Fig.1 Structural composition of flavor compound of Baijiu samples brewed from different sorghum varieties

酒樣香味物質的PCA結果見圖2。由圖2可知，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）的累計方差貢獻率為92.80%，說明已提取到原始數據的絕大部分信息。Two-wayPERMANOVA分析結果表明，酒樣香味物質的結構組成受到酒廠、高粱品種以及兩者交互作用的顯著影響（P＜0.05）。

圖2 不同品種高粱釀造酒樣香味物質的主成分分析Fig.2 Principal component analysis of Baijiu samples brewed from different sorghum varieties

2.3 酒樣差異香味物質的篩查

因酒樣香味物質的結構組成具有酒廠差異，分別以區分和不區分酒廠的兩種方式篩查不同高粱酒樣的差異香味物質以確定兩者之間的交集。若某一物質在兩種篩查方式中均被獲得，且品種間的含量倍數變化一致，說明其受酒廠因素的影響較小，是酒樣中較可靠的差異香味物質。如圖3所示，兩個酒廠篩查出的差異香味物質數量及其種類具有顯著差異，其中共有11個不同的差異香味物質穩定存在于不同高粱的酒樣之間，并且在兩種篩查方式中的含量變化趨勢一致（表2）。由表2可知，金糯粱1號酒樣的甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙醛、乙縮醛和3-甲基丁醛以及瀘州紅1號酒樣的甲酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、己酸和辛酸含量顯著高于澳洲AZ酒樣；金糯粱1號酒樣的甲酸乙酯和亞油酸乙酯含量顯著低于瀘州紅1號，但異戊酸含量顯著高于瀘州紅1號。

表2 不同品種高粱釀造酒樣的差異香味物質Table 2 Differential flavor compounds of Baijiu samples brewed from different sorghum varieties

圖3 不同品種高粱釀造酒樣差異香味物質的韋恩圖Fig.3 Venn diagrams of differential flavor compounds of Baijiu samples brewed from different sorghum varieties

2.4 酒樣香味物質和高粱理化成分的相關性分析

由表3可知，酒樣香味物質與高粱的粗蛋白、粗脂肪、粗淀粉、單寧和支鏈淀粉含量均顯著相關（P＜0.05）。以酒樣香味物質PCA的PC1數值為因變量，高粱理化成分為自變量構建多元線性回歸模型，結果見表4。由表4可知，單寧和支鏈淀粉含量對PC1的數值具有顯著影響（P＜0.05），說明它們是影響酒樣香味物質組成結構的主要因子。基于回歸模型，建立了基于單寧（X4）和支鏈淀粉（X5）預測PC1數值的回歸方程：PC1=-28.178-3.261X4+0.359X5。回歸方程的R2為0.337，表明對PC1 數值變化的解釋度為33.70%。

表3 不同品種高粱釀造酒樣香味物質和高粱理化成分的Pearson相關性分析結果Table 3 Pearson correlation analysis results of flavor compound of Baijiu samples brewed from different sorghum varieties and physicochemical properties of sorghum

表4 高粱理化成分對酒樣香味物質主成分1數值的多元線性回歸分析Table 4 Multiple linear regression analysis of physicochemical properties of sorghum and principal component 1 of flavor compounds of Baijiu samples

2.5 酒樣差異香味物質和高粱理化成分的相關性分析

由圖4可知，甲酸乙酯、乙酸乙酯和乙縮醛的含量與粗蛋白、粗脂肪和粗淀粉的含量呈顯著負相關（P＜0.05），與單寧和支鏈淀粉的含量呈顯著正相關（P＜0.05）。以酒樣差異香味物質為因變量，高粱理化成分為自變量構建多元線性回歸模型見表5。由表5可知，有6個差異香味物質的含量受到高粱理化成分的顯著影響（P＜0.05）。其中，亞油酸乙酯、乙醛和3-甲基丁醛的含量受單寧和支鏈淀粉的共同影響，甲酸乙酯和異戊酸含量受單寧影響，乙縮醛受支鏈淀粉的影響。建立了基于單寧和支鏈淀粉預測以上差異香味物質含量的回歸方程，相關系數R2為0.292～0.663，表明對預測變量的解釋度為29.20%～66.30%。

圖4 酒樣差異香味物質和高粱理化成分間的Pearson相關性分析結果Fig.4 Pearson correlation analysis results between differential flavor compounds of Baijiu samples and physicochemical properties of sorghum

表5 高粱理化成分對酒樣差異香味物質的多元線性回歸分析Table 5 Multiple linear regression analysis of physicochemical properties of sorghum on differential flavor compounds of Baijiu samples

續表

2.6 酒樣感官品評

不同品種高粱釀造酒樣的感官品評結果見表6。由表6可知，瀘州紅1號和金糯粱1號酒樣的感官風味相似，均優于澳洲AZ酒樣。

表6 不同品種高粱釀造酒樣的感官品評結果Table 6 Sensory evaluation results of Baijiu samples brewed from different sorghum varieties

3 討論

3.1 酒樣香味物質的結構組成

以往研究解析了不同品種高粱的大生產釀造酒質差異[9-13]，但相關試驗僅在一個酒廠開展。本研究結果表明，除高粱品種外，酒樣香味物質的結構組成還因酒廠的不同而具有顯著差異。同一原料釀造酒質具有的酒廠差異可能與多種因素有關。研究表明，白酒香味物質的形成受釀酒原料、生產工藝、氣候環境等因素的影響[19-21]。雖然本研究保證了高粱品種和釀酒工藝的一致，生產也由同一批工人操作，但仍無法完全消除外部因素的影響。如在長期的釀酒生產中，不同酒廠的環境中可能會形成獨特的釀酒微生物區系[22]，影響白酒發酵，造成相同原料出現不同的釀造效果。因此，要準確評價不同原料的釀造酒質差異必須以多酒廠、多批次的釀造試驗為基礎。已往生產經驗雖已總結出“相同原料的釀造酒質具有酒廠差異”，但本研究為這一生產經驗提供了強有力的數據支撐。

3.2 酒樣的差異香味物質

乙酸乙酯是清香型白酒的主體香味物質，其含量對酒質具有重要影響[14]。本研究發現，瀘州紅1號和金糯梁1號酒樣的乙酸乙酯含量顯著高于澳洲AZ，這可能是它們小曲清香風格更為純正的原因之一。乙醛是白酒的主要醛類物質，味甜帶澀，含量過高可能造成酒體刺鼻、口感辛辣[23]。本研究發現，金糯梁1號酒樣的乙醛含量雖顯著高于澳洲AZ，但其口感無明顯辛辣味。造成此現象的原因可能包括兩方面：一是金糯梁1號酒樣的乙醛含量雖高，但仍處于可接受的范圍；二是其他物質產生的味覺刺激可能對乙醛引起的辛辣味具有消除作用。風味物質之間具有相互作用，除絕對含量外，風味物質在食品中的分布情況對人體的感知強度也具有重要影響[24]。目前研究從不同香型白酒中檢測出上千種香味物質[18]，其結構組成對酒質口感的影響亟待進一步破解。

3.3 高粱理化成分和香味物質的相關性

高粱富含淀粉、蛋白和單寧等理化成分，含量具有品種差異，是指導品種選育的核心指標[1，25]。作為中國白酒的主產區，四川已將培育“綠色高效釀酒專用糧重大新品種”列入十四五重大科技專項，解析高粱理化成分和白酒香味物質間的關系可為新品種的培育提供明確的性狀選育方向。基于實驗室發酵試驗，有研究發現，高粱的單寧和脂肪與白酒香味物質的含量變化顯著相關[2-3]。基于大生產釀造，本研究發現酒樣香味物質的結構組成與粗蛋白、粗脂肪、粗淀粉、單寧和支鏈淀粉的含量均相關，其中單寧和支鏈淀粉對差異香味物質的形成具有顯著影響，提示新品種的選育工作應重點關注這兩個指標。目前研究尚未闡明高粱理化成分影響白酒香味物質形成的作用機制，但有研究發現在釀酒過程中，不同單寧含量酒醅的優勢菌群存在顯著差異[26-27]，提示原料理化成分含量的差異對微生物種群具有選擇作用。那么，由高粱理化成分含量差異引起的菌群結構及其功能差異對理化成分的代謝流向產生了什么影響，又是如何導致酒體差異香味物質的形成等科學問題還需進一步研究。

4 結論

本研究探明了3種高粱釀造清香型白酒的差異香味物質，明確了單寧和支鏈淀粉是影響香味物質結構組成的主要因子，初步建立了以單寧和支鏈淀粉為自變量預測酒樣差異香味物質含量的多元回歸方程。本研究還證明了白酒香味物質的結構組成受到高粱品種和釀造酒廠的交互影響，后續研究將系統性開展多酒廠、多批次釀造試驗，進一步優化和完善相關回歸模型來指導釀酒生產。