牧草標本制作與保存方法研究

李興美，蔡 閱，何 勇

(1.貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學院，貴陽 551400； 2.貴州師范學院，貴陽 550018)

牧草含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)，是重要的畜牧飼料來源。其還可保護土壤，提高土壤質(zhì)量，豐富生物多樣性[1]。也有綠化街道、觀賞及作為蜜源等作用，具有良好的經(jīng)濟價值、生態(tài)效益和社會效益。

標本從時間、空間、物種等多方面都具有豐富的物種信息，有利于植物分類、科研、教學和種質(zhì)資源保護工作的開展[2]。當外來物種入侵，導(dǎo)致一些物種急劇減少甚至滅絕時，種子標本將發(fā)揮重要的作用。目前，牧草植物資源主要在種質(zhì)庫和資源圃，大多以種子和植株的形式保存。植物標本的制作方法主要有種子保存、原色浸制和干制等，其中原色浸漬標本可保存植物原有顏色，具有形態(tài)逼真、色澤鮮艷、利于觀察等特點。因某些植物形態(tài)較為相似，僅通過圖片、文字難以辨認，可通過浸漬標本進行觀察分辨，更為直觀地對比學習。

本試驗研究了牧草浸漬標本的固綠和浸漬方法，探索最佳處理及最佳保存液配比，分析牧草種子標本的制作，為牧草鑒別和稀缺植物種質(zhì)資源基因的保存提供理論參考。

1 試驗試劑與器材

1.1 試驗試劑

無水亞硫酸鈉購自天津市登峰化學試劑廠；乙酸銅購自天津市北辰方正試劑廠；乙醇、冰醋酸購自天津市富宇精細化工有限公司；丙三醇購自福晨(天津)化學試劑有限公司；甲醛溶液購自重慶川東化工有限公司；石蠟購于上海龍圖蠟業(yè)有限公司。

1.2 試驗器材

標本瓶購于建湖玻璃廠家，DK-S26電熱恒溫水浴鍋購于上海冉繪實業(yè)有限公司，101-0BS電熱恒溫鼓風干燥箱、高壓蒸汽滅菌鍋購于上海力辰儀器科技有限公司，鋁盒購于上虞圣超儀器設(shè)備有限公司，YP5002電子天平購于上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 標本材料

試驗主要采用5種常見的牧草植物：豆科植物紫花苜蓿(Medicagosativa.)、禾本科植物黑麥草(LoliumperenneL.)、菊科植物串葉松香草(SilphiumperfoliatumL.)、蓼科植物苦蕎麥(Fagopyrumtataricum(L.)Gaertn.)、蓼科植物甜蕎(Fagopyrumesculentummoench.)，均來源于實驗種植。

2 浸漬標本制作

2.1 制作原理

植物葉綠素是一種復(fù)雜的有機化合物，易溶于福爾馬林、酒精等保存液，使其綠色消失而呈黃褐色。葉綠素分子結(jié)構(gòu)的中心是鎂離子，用銅離子代替鎂離子的位置，可使植物葉綠素分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，呈現(xiàn)綠色，達到長期保持植物綠色的目的，是最常用的綠色植物標本的固綠方法[3]。

2.2 標本處理

浸漬標本制作：采集新鮮標本后，于30 min內(nèi)完成固綠處理。具體步驟為：樣本采集，放在陰涼避光處或冷水中，否則植株很容易萎蔫變形。將采集的標本植株進行清洗、修整，即去掉枯葉、黃葉、爛葉并對過于密集的部分進行修剪，不能破壞植株的完整性，保留牧草品種特征部位。用乙醇進行消毒5 min后，用蒸餾水沖洗干凈，再浸泡于蒸餾水10～15 min。沖洗3次，使表面潔凈后備用[4]。

2.3 固色液的制作

標本固綠處理液配制：準確稱取6 g醋酸銅結(jié)晶，量取100 mL冰醋酸，將醋酸銅溶于冰醋酸中，再量取300 mL蒸餾水稀釋，制成固綠液。

2.4 保存液的制作

浸漬標本保存試劑的選擇：無水亞硫酸鈉，呈晶體狀，價格低廉、來源方便，具有防腐、抗氧化、護色及保鮮等作用，試劑配制溶液時操作方便且無刺激性氣味，加入一定量甘油作為植物色澤保持劑。配制亞硫酸鈉溶液的濃度分別為0.08%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，作為保存液備用，甘油溶液濃度為≥99.0%和0.08%亞硫酸鈉+1 mL甘油溶液、0.1%亞硫酸鈉+1 mL甘油溶液、0.2%亞硫酸鈉+1 mL甘油溶液、0.3%亞硫酸鈉+1 mL甘油溶液、0.4%亞硫酸鈉+1 mL甘油溶液，作為保存液備用，并與常用保存液福爾馬林進行對比，福爾馬林溶液濃度為5%。

2.5 標本制作

將固綠液用恒溫水浴鍋加熱，設(shè)置溫度為85℃，將處理后的牧草植株放入固綠液中，保持恒溫加熱，小心翻動，使標本均勻接觸藥液，直到植物體由綠變黃褐色，再由黃褐逐漸轉(zhuǎn)綠接近原色時，將植物體取出，用蒸餾水洗凈，將標本分別放入大小適宜的標本瓶中，分別加入配制好的保存液，加蓋，密封。貼上標簽，注明制作時間、植物名稱等信息。

2.6 試驗設(shè)計

將每個濃度三組重復(fù)，以避免偶然性并減小誤差。

3 種子標本制作

材料來源。實驗材料種子采集自貴州省安順地區(qū)和畢節(jié)地區(qū)。

標本篩選。將雜質(zhì)、干癟、蟲蛀、霉爛、有缺損的種子進行剔除，把大小均勻的挑出備用，不同種類的種子要分開放置，切忌弄混，尤其是當兩種或多種種子的外觀相似時，后期不易挑選，易導(dǎo)致標本污染。

標本處理。將種子烘干后保存，種子含水量高容易發(fā)生霉變腐爛，將5種牧草種子放在鋁盒中用電熱恒溫鼓風干燥箱烘干水分，烘干時鋁盒要打開蓋子，烘好后將蓋子蓋好取出，待種子涼透后進行下一步操作，防止發(fā)生結(jié)露現(xiàn)象，影響保存效果[5]。

實驗設(shè)計。分別將5種牧草種子標本質(zhì)量分三級保存，即一級、二級、三級[6-12]。

4 標本保存

4.1 浸漬標本的保存

將經(jīng)過固綠處理的標本分別放入大小適宜的標本瓶中，配制好的保存液分別慢慢加入標本瓶中至瓶滿，加蓋，密封[13]。封口嚴密，如有空氣進入標本保存時很容易腐爛、變色，將石蠟切成小塊熔化后，用刷子將融化石蠟涂于瓶子接縫處，貼上標簽，注明制作時間、植物名稱等信息[14]。將制作好的標本放于陰涼避光位置，盡量避免標本轉(zhuǎn)移、晃動，起初3 d每天觀察1次，后續(xù)每隔2～3 d天觀察1次。記錄保存液是否渾濁、變色，若變化則按照原來的配方將保存液更換，同時觀察標本顏色、形態(tài)是否變化，做好觀察記錄。

4.2 種子標本的保存

標本瓶使用前用清水清洗干凈再用高壓滅菌鍋滅菌，將處理好的種子按種類、大小分別裝入種子標本瓶內(nèi)，塞好瓶口后用石蠟在連接處密封嚴實，在瓶身上貼上標簽，記錄好該標本名稱、日期、來源、編號等信息。將制作好的標本按照種類分開存放，標本柜內(nèi)適當放置一些干燥劑，保持存放環(huán)境干燥，同種按編號有序存放。為了方便后期保管查詢，可按照標本放置順序編寫記錄本，當存放的標本變多時可快速查詢到標本信息，管理標本時要經(jīng)常檢查記錄標本有無變化。經(jīng)過處理的牧草種子標本在保存3個月后顆粒完整，沒有出現(xiàn)蟲蛀、潮濕霉爛等現(xiàn)象，同種種子未經(jīng)過處理直接放進標本瓶保存，有的出現(xiàn)發(fā)霉蟲蛀現(xiàn)象，則保存失敗。如果標本管理不出現(xiàn)問題，制作處理對于標本保存時間的長短將起著至關(guān)重要的作用。

5 結(jié)果與分析

5.1 浸漬標本

將5種經(jīng)過固綠處理的植物浸漬標本分別裝入不同保存液標本瓶中，觀察記錄保存效果，放置3個月后進行優(yōu)、良、差3個等級的評價，3個等級保存效果的具體評價標準分別為：優(yōu)表示植物保持原有色澤，不腐爛、變質(zhì)，形態(tài)逼真，有較好的立體感；良表示植物有褪色現(xiàn)象，但是色澤還在，沒有出現(xiàn)腐爛、變質(zhì)，形態(tài)略有失真，立體感較之前變差；差表示植物失去了原來的顏色，已經(jīng)沒有立體感、真實感。

通過表1觀察結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，用濃度為0.1%亞硫酸鈉溶液保存綠色牧草浸漬標本效果最好，5種不同濃度分別在加入1 mL甘油后，0.1%亞硫酸鈉+1 mL甘油溶液效果最好，亞硫酸鈉溶液大多數(shù)可有效保存標本，而用5%福爾馬林溶液保存的效果有的不夠好，整體是0.1%亞硫酸鈉溶液和0.1%亞硫酸鈉+1 mL甘油溶液效果更好。

表1 不同牧草不同濃度保存液標本的三個等級Tab.1 Three grades of different herbage and concentrations of preservation specimens

5.2 種子標本

種子標本要體現(xiàn)種子質(zhì)量，達到干、凈、飽、壯、健的程度，具有品種特征的真實性、純度高、發(fā)芽率高、生活力強、營養(yǎng)成分符合要求等生物學特性。根據(jù)國家現(xiàn)行標準，將5種牧草種子的凈度、純度、發(fā)芽率、水分4項主要指標參照《中華人民共和國農(nóng)作物質(zhì)量標準》判定牧草種子是否合格，根據(jù)種子純度指標將牧草種子劃分3級。如表2，一級種子標本凈度最高達到99.0%，最低是90.0%；發(fā)芽率至少在80.0%以上，水分均為10.0%左右。三級之外，種子不適宜作標本，保存期不長及保存意義不大，因為種子標本除了有利于物種種子外觀的鑒別，也為瀕危牧草物種種質(zhì)資源基因儲備提供了新思路。

表2 5種牧草種子標本質(zhì)量分級 一級、二級、三級Tab.2 Quality classification of 5 forage seed specimens the first, second and third degrees

續(xù)表2

6 討論與結(jié)論

因植物原色標本的固綠和保存較特殊，不同的種類植物、生長地點、含水量都會影響標本制作的色差[15]。不同植物有不同的化學成分和含水量，對其固綠有不同的處理。本試驗主要探索牧草浸漬標本保存液的可行性及牧草種子標本制作，采用不同濃度的亞硫酸鈉溶液、不同濃度亞硫酸鈉溶液+1 mL甘油、5%福爾馬林溶液保存液進行對比分析。標本后續(xù)需要養(yǎng)護和適當管理才能延長標本使用壽命。田麗娟等[16]對浸漬標本保存出現(xiàn)的問題和保存策略進行了研究，可合理運用這些管理策略延長標本保存時間。

試驗結(jié)果表明，亞硫酸鈉適用于制作牧草植物原色浸漬標本的保存液。由于不同植物質(zhì)地不同，進行固綠處理時要掌握好時間，注意觀察顏色變化，避免時間過長導(dǎo)致熟爛，制作的標本無法使用。如對甜蕎、苦蕎嫩葉進行固綠時，由于植物太嫩，固綠結(jié)束時容易萎蔫，形態(tài)變差導(dǎo)致無法使用。保存液是標本能否長久保存的關(guān)鍵，如用純凈水保存標本半個月后基本就枯萎腐爛，用濃度60%、70%、75%的乙醇作為保存液均在幾天后褪色嚴重，保存失敗。植物體內(nèi)的構(gòu)成比較復(fù)雜，因此原色浸漬標本的制作也比較復(fù)雜。植物標本形式多種多樣，如電子標本的使用，但其他標本不可能完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)標本[17]。如珍貴物種實體標本保存或新發(fā)現(xiàn)的物種，可以和傳統(tǒng)標本進行對比研究，從傳統(tǒng)標本中提取DNA樣品[18]。牧草對于生產(chǎn)生活有著重要的作用，其種子是生物資源的重要組成部分[19]，可以用本土種子標本與其他地區(qū)進行交換，豐富種質(zhì)資源，不斷收集資料，了解生態(tài)環(huán)境，保護植物資源。種子標本除了觀賞和科研以外，還能為物種預(yù)留儲備基因，因此對其進行有效保存是很重要的。