靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料研制

熊亞琴，羅建光

（1.淮安生物工程高等職業學校，江蘇 淮安 223232；2.江蘇食品藥品職業技術學院，江蘇 淮安 223023）

靈芝（Ganoderma lucidum）又名赤芝、萬年蕈、靈芝草，是一種多孔擔子菌亞門藥食用真菌的子實體，富含靈芝多糖、靈芝酸、氨基酸、微量元素等物質，具有免疫調節、安神益腦、補氣活血、提高機體耐缺氧能力、清除自由基、預防腫瘤等作用[1-4]。發芽糙米含有豐富的維生素B族、生育酚、膳食纖維、肌醇六磷酸鹽、γ-氨基丁酸等營養元素，其中γ-氨基丁酸對改善人體的神經系統、心血管系統、新陳代謝、肝臟功能具有良好的功能[5]。蒲公英又名婆婆丁、黃花地丁，多年生草本植物，有“天然抗生素”的美譽，為傳統藥食同源材料，含有豐富的甾醇、菊糖、膽堿、有機酸、維生素、胡蘿卜素、微量元素等，具有抗菌消炎、清熱解毒、健胃散結、消腫利尿、保肝利膽、抗病毒等功能[6-11]。

目前，隨著飲料產業不斷轉型升級，健康化、營養化飲料的研究開發越來越受到重視。以靈芝子實體、發芽糙米和蒲公英為原料開發的產品較多[12-14]；而以發芽糙米為主要原料，通過靈芝液體發酵和添加野生蒲公英提取物研制復合飲料的研究在國內尚未見報道。為此，以發芽糙米為原料進行靈芝液體發酵，獲得靈芝發酵液，再添加蒲公英提取物、木糖醇和檸檬酸等輔料，開發出一種既具有獨特風味和清鮮口感，又保留了靈芝、發芽糙米和蒲公英原有營養保健功效的復合飲料，為靈芝、發芽糙米和蒲公英進一步開發利用提供理論支持，開辟出靈芝、發芽糙米和蒲公英等相關復合飲料研制的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種:靈芝（赤芝，紅靈芝、CICC14042），中國工業微生物菌種保藏管理中心提供。

發芽糙米粉、發芽黃豆粉，新鮮的糙米、黃豆經實驗室發芽、烘干、粉碎、過60目篩加工制成。

發芽大麥粉，購自淮安廣濟大藥房，經粉碎過60目篩加工制成。

葡萄糖、NaCl、CaCO3、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4，無錫市亞泰聯合化工有限公司提供；蛋白胨、瓊脂，上海博微生物科技有限公司提供；麥芽糖，江蘇先卓食品科技股份有限公司提供；海藻酸鈉、CMC-Na、檸檬酸、木糖醇，河南千志商貿有限公司提供。

1.2 儀器與設備

DLSB-5L/20型低溫冷卻液循環泵，鞏義市子華儀器有限責任公司產品；101-3A型數顯式電熱恒溫干燥箱，上海陽光實驗儀器有限公司產品；ZG-1M2型真空冷凍干燥機組，杭州創意真空冷凍干燥設備廠產品；TDL-40C型低速臺式大容量離心機，上海安亭科學儀器廠產品；ZWY-2102型恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司產品；SHA-C型恒溫水浴振蕩器，常州榮華儀器制造有限公司產品；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠產品；SW-CJ-2FD型雙人單面垂直凈化工作臺，江蘇通凈凈化設備有限公司產品；GNP-9050型隔水式恒溫培養箱，上海三發科學儀器有限公司產品；RE-3000A型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠產品。

1.3 方法

1.3.1 靈芝發芽糙米發酵液的制備

（1）菌種活化。從靈芝母種斜面上取一塊約0.5 cm2大小的菌塊置于PDA斜面培養基上，在25℃恒溫培養箱中培養7 d，制得活化斜面菌種。

（2）種子培養。在250 mL錐形瓶中裝入100 mL種子培養基，高壓蒸汽滅菌后冷卻至室溫，于無菌條件下接入活化的2～3菌塊（5 mm2），然后置于搖床中，于28℃下以轉速180 r/min培養7 d，制得液體靈芝菌種。

（3）液體發酵。在500 mL三角瓶中裝入200 mL液體發酵培養基，高壓蒸汽滅菌后冷卻至室溫，于無菌條件下按5%接種量接入種子培養基，發酵培養7 d（溫度28℃，轉速180 r/min）。

1.3.2 靈芝發酵液的制備

將液體發酵培養基倒入離心管中離心（離心轉速4 000 r/min）→吸取上清液→得到發酵液原液。

1.3.3 蒲公英提取物的制備

將采集的蒲公英洗凈、烘干→打成顆粒度較大的粉末（30 s）→過50目篩→加入純凈水在60℃提取2次→抽濾真空泵粗過濾→旋轉蒸發儀進行濃縮→真空冷凍干燥成粉末。

1.3.4 靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料加工工藝

原液→加入蒲公英提取物→調配→均質→灌裝、排氣、封口→加熱殺菌→冷卻→貼標→成品。

1.3.5 操作要點

①培養基配制時要注意攪拌均勻，以防止沉淀和煳底；②接種要保證在無菌的條件下操作，操作人員應該預先對接種培養基進行滅菌，再在超凈工作臺下用紫外燈照射15～30 min，再用酒精對帶有手套的雙手消毒后再進行接種；③接種時接種鏟溫度不宜過高，會將靈芝菌種燙死；④接種操作時要注意瓶塞擺放的位置、瓶塞與錐形瓶的間距；⑤接種結束后，應立即放置于搖床內進行培養；⑥蒲公英打粉要注意時間應該控制在30～35 s；⑦蒲公英濃縮時應注意旋轉蒸發儀中溶液的體積，旋轉蒸發的轉速不宜過高；⑧蒲公英提取物配制飲料添加時應注意快速稱取，防止其吸潮，產生質地上的變化；⑨飲料均質應該注意轉速不宜過高，以防止飲料產生大量的泡沫，而影響產品的感官品質。

1.3.6 單因素試驗設計

（1）發酵液添加量的確定。以10%，20%，30%，40%，50%的發酵液分別添加4%木糖醇，0.01%檸檬酸，0.45%蒲公英提取物，用純凈水定容至100 mL，即100 mL中發酵液體積分別為10，20，30，40，50 mL，按此方法分別制成的靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料進行感官評定，確定最佳的發酵液添加量。

（2）蒲公英提取物添加量的確定。以添加量0.15%，0.25%，0.35%，0.45%，0.55%的蒲公英提取物分別添加40%發酵液，4%木糖醇，0.01%檸檬酸，用純凈水定容至100 mL，即100 mL中蒲公英提取物添加量分別為0.15，0.25，0.35，0.45，0.55 g，按此方法分別制成的靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料進行感官評定，確定最佳的蒲公英提取物添加量。

（3）木糖醇添加量的確定。以2%，4%，6%，8%，10%的木糖醇分別添加40%發酵液，0.45%蒲公英提取物，0.01%檸檬酸，用純凈水定容至100 mL，即100 mL中木糖醇用量分別為2，4，6，8，10 g，按此方法分別制成的靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料進行感官評定，確定最佳的木糖醇添加量。

（4）檸檬酸添加量的確定。以添加量0.005%，0.010%，0.015%，0.020%，0.025%的檸檬酸都分別添加40%發酵液，0.45%蒲公英提取物，4%木糖醇，用純凈水定容至100 mL，即100 mL中檸檬酸用量分別為0.005，0.010，0.015，0.020，0.025 g，按此方法分別制成的靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料進行感官評定，確定最佳的檸檬酸添加量。

1.3.7 正交優化試驗

在單因素試驗設計基礎上，采用正交試驗L9（34）對靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料的配方進行篩選，以靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料的感官評分作為考查指標，通過后期的正交試驗考查各個因素相互之間的影響，確定靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料的最佳配方。

靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料正交試驗因素與水平設計/%

1.3.8 穩定劑的選擇試驗

穩定劑可以抑制因重力作用而沉淀的大分子顆粒下沉，一定程度上讓產品長時間保持均一和穩定。試驗中選擇飲料加工常用的海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）2種穩定劑，以不同的復配比例按照0.3%添加量進行試驗，確定穩定劑的最佳添加量。

1.3.9 產品感官品質評定標準

按照感官綜合評分方法，隨機選取10名具有食品專業背景和感官評定經驗的品鑒人員對靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料樣品進行隨機感官評價，以其平均分作為該復合飲料的總感官評分。

感官評定標準見表2。

表2 感官評定標準

1.3.10 產品理化及微生物質量評定標準

（1）理化檢驗。鋅測定，參考《GB 5009.14—2017食品安全國家標準 食品中鋅的測定》；銅測定，參考《GB 5009.13—2017食品安全國家標準 食品中銅的測定》；鐵測定，參考《GB 5009.90—2016食品安全國家標準食品中鐵的測定》；氰化物測定，參考《GB 5009.36—2016食品安全國家標準食品中氰化物的測定》；靈芝多糖檢測采用苯酚-硫酸比色法[15]；γ-氨基丁酸采用苯酚-次氯酸鈉比色法[16]。

（2）微生物檢驗。菌落總數按《GB 4789.2—2016食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》計數；大腸菌群按《GB 4789.3—2016食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》中規定的方法計數；霉菌、酵母按《GB 4789.15—2016食品安全國家標準食品微生物學檢驗 霉菌和酵母》計數。

2 結果與分析

2.1 發酵液添加量對飲料品質的影響

發酵液添加量對靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料品質的影響見圖1。

圖1 發酵液添加量對靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料品質的影響

由圖1可知，隨著發酵液添加量的增大，靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料的感官評分逐漸增加，當添加量為40%時，飲料的感官評分到達最高，考慮可能是在發酵液添加量不足時，飲料溶液的稀釋比較大，受到其他因素的影響較大，不足以凸顯發酵液的特殊風味，其次在低添加量時，靈芝的有效成分含量不足，無法顯現出保健功能。而在發酵液添加量大于50%時，由于發酵液本身具有的苦澀感無法被其他因素所掩蓋，而使飲料的感官評分下降，說明添加量過高對感官評定人員來說認可度不高，所以綜合考慮選擇添加量30%，40%，50%作為正交試驗的因素水平。

2.2 蒲公英提取物添加量對飲料品質的影響

蒲公英提取物添加量對靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料品質的影響見圖2。

由圖2可知，隨著蒲公英提取物添加量的增大，靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料的感官評分逐漸增加，當添加量為0.35%時，飲料的感官評分到達最高，當添加量較低時不足以彰顯蒲公英的特殊風味與香氣，色澤也較淡，而當添加量較高時，蒲公英苦澀味明顯，飲料顏色呈現明顯的棕黑色和深棕色，不符合大部分感官評定人員的一般口味。蒲公英提取物經過旋轉蒸發儀濃縮和真空冷凍干燥，提取物中風味物質濃度比較大，對飲料的色澤和香氣影響較大，所以適量添加才更符合大眾對飲料的基本要求。因此，綜合考慮選擇添加量0.35%，0.45%，0.55%作為正交試驗的因素水平。

圖2 蒲公英提取物添加量對靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料品質的影響

2.3 木糖醇添加量對飲料品質的影響

木糖醇添加量對靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料品質的影響見圖3。

圖3 木糖醇添加量對靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料品質的影響

由圖3可知，隨著木糖醇添加量的增大，靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料的感官評分先增加后較為平緩地逐漸降低，先增加的原因在于檸檬酸定量時，適當增大木糖醇添加量，可達到適宜的飲料糖酸比，而后逐漸下降。分析原因為超量的木糖醇對飲料糖酸比影響較大，甜味過高會直接影響飲料的總體滋味，也會增加飲料的制作成本。由于木糖醇本身的甜度是蔗糖的1.2倍，差異度不大，但是木糖醇溶解時會吸收大量的熱量，故會產生一種爽口的感覺，對飲料的滋味具有改善作用，但是攝入量過大會造成腹瀉等風險，所以綜合考慮選擇添加量2%，4%，6%作為正交試驗的因素水平。

2.4 檸檬酸添加量對飲料品質的影響

檸檬酸添加量對靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料品質的影響見圖4。

由圖4可知，檸檬酸添加量相對較少，但是感官評分趨勢變化較大，隨著檸檬酸添加量的增大，靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料的感官評分先增加后呈直線降低，先增加的原因在于木糖醇的固定時，適當增加檸檬酸添加量，可以使飲料滋味達到合適酸甜度，而后稍有增大檸檬酸添加量，便會使飲料的酸感明顯；同時，由于檸檬酸的酸感不太柔和，再加上蒲公英提取物中含有一些酸性物質，結果造成飲料的酸感突出，使飲料的感官評分呈直線下降。因此，綜合考慮選擇添加量0.005%，0.010%，0.015%作為正交試驗的因素水平。

圖4 檸檬酸添加量對靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料品質的影響

2.5 靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料最佳配方的確定

靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料正交試驗結果見表3。

表3 靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料正交試驗結果

由表3可知，影響靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料感官評分的主次因素為蒲公英提取物添加量（B）〉檸檬酸添加量（D）〉發酵液添加量（A）〉木糖醇添加量（C）。由此可見，蒲公英添加量對飲料的感官評分的影響顯著性較大，得到的最優組合為A2B2C2D1，并不在正交試驗的9組試驗中，但是通過超過3次的驗證試驗，其感官評分每次都高于任何一組的試驗結果，感官評分得到88分。最終確定靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料的最佳配方為發酵液添加量20%，蒲公英添加量0.35%，木糖醇添加量4%，檸檬酸添加量0.005%。

靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料方差分析結果見表4。

由表4可知，蒲公英添加量和檸檬酸添加量對靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料的顯著性較大，所以確定最佳組合時才需要考慮飲料中蒲公英和檸檬酸的最適添加量。

表4 靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料方差分析結果

2.6 穩定劑對產品穩定性的影響

試驗參照單垣愷等人[17]方法略作修改，將飲料常用的穩定劑CMC-Na與海藻酸鈉進行復配，加0.3%于飲料中，并比較了不同復配比例對飲料穩定效果。

不同穩定劑對靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料穩定性影響見表5。

表5 不同穩定劑對靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料穩定性影響

由表5可知，CMC-Na與海藻酸鈉按照1∶2比例進行復配，形成的穩定劑對復合飲料穩定效果最佳，因而，在復合飲料加工過程中，選擇0.1%CMC-Na和0.2%海藻酸鈉作為復配穩定劑。

2.7 靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料質量標準

2.7.1 感官指標

香氣：有靈芝和蒲公英的特殊香氣，無異香，無臭味；滋味：有靈芝和蒲公英的應有滋味，無雜味，異味；色澤：具有清亮的棕褐色或淡咖啡色，溶液成半透明狀；狀態：均勻一致，有一定黏度，無雜質，無沉淀。

2.7.2 產品理化指標

鋅、銅、鐵總和15 mg/L，氰化物（以HCN計）0.02 mg/L，酸度pH值5.2，可溶性固形物3.1%，γ-氨基丁酸131.62 mg/L，靈芝多糖0.922 mg/L。

2.7.3 產品微生物指標

細菌總數40 CFU/mL，大腸桿菌總數6 MPN/mL，霉菌總數12 CFU/mL，酵母總數9 CFU/mL，致病菌未檢出。

3 結論

以研制出一款色香味形較佳的靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料為試驗目的，將發酵液添加量、蒲公英提取物添加量、木糖醇添加量、檸檬酸添加量作為4個因素考查，以感官評分作為評定指標，最終通過正交試驗，得到產品的最佳配方為發酵液添加量40%，蒲公英提取物添加量0.35%，木糖醇添加量4%，檸檬酸添加量0.005%。此外，復配穩定劑添加量為0.3%（羧甲基纖維素鈉與海藻酸鈉之比為1∶2）時，靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料穩定性最佳。由此配比制得的靈芝發芽糙米蒲公英復合飲料，具有濃郁的靈芝與蒲公英的特殊香氣，風味獨特，色澤黃褐。該飲料的各項檢測指標均達到國家的標準，符合當代消費者對安全、營養、綠色、功效食品的要求。