不同發(fā)酵溫度對液體發(fā)酵飼料營養(yǎng)成分、揮發(fā)性脂肪酸和活菌數(shù)的影響

郭曉宇，丁 德

（1.吉林工程職業(yè)學(xué)院，吉林四平 136001；2.吉林省禾豐種豬繁育有限公司，吉林四平 136100）

液體發(fā)酵飼料通常指將飼料與水按照一定比例均勻混合發(fā)酵而成的飼料，含水量通常在60%以上，采用液體輸送系統(tǒng)進(jìn)行飼喂。發(fā)酵所用菌種主要是乳酸菌。相對于固體發(fā)酵飼料，液體發(fā)酵飼料含水量高，發(fā)酵產(chǎn)生的酸香味更濃，適口性好；液體發(fā)酵更有利于益生菌的快速生長繁殖，增強(qiáng)其益生作用，提高飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的消化率，并能有效抑制或殺滅病原微生物（沙門氏菌和大腸桿菌）。另外，液體飼料不存在粉塵現(xiàn)象，也能避免豬群發(fā)生呼吸道疾病。本試驗(yàn)研究植物乳桿菌在不同溫度下發(fā)酵液體飼料，對飼料營養(yǎng)成分、乳酸、乙酸、丙酸等揮發(fā)性脂肪酸以及乳酸菌活菌數(shù)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 植物乳桿菌（活菌數(shù)＞109CFU/g）和釀酒酵母（活菌數(shù)＞109CFU/g）由北京某生物有限公司提供。試驗(yàn)所用試驗(yàn)為生長育肥豬全價配合飼料，參照《NY/T 65-2004 豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》配制，飼料配方及營養(yǎng)成份見表1。

表1 飼料組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.2 試驗(yàn)設(shè)計 試驗(yàn)分別設(shè)定20、25、30℃三個發(fā)酵溫度，每個發(fā)酵溫度設(shè)置6個重復(fù)。每個重復(fù)準(zhǔn)確稱取100.0 g配制好的全價配合飼料，裝入250 mL發(fā)酵瓶（瓶蓋安裝有水封式單向排氣閥）中，添加適量的干凈溫水，調(diào)節(jié)飼料含水量至60%，然后按照1%的比例接種植物乳桿菌和酵母菌（植物乳桿菌∶釀酒酵母=1∶1）至液體飼料中，攪拌均勻，蓋緊瓶蓋后分別放置在恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵24 h。

1.3 指標(biāo)測定與方法

1.3.1 飼料中營養(yǎng)成分 發(fā)酵結(jié)束后，將飼料樣品置于烘箱中，105℃下30～60 min，然后調(diào)節(jié)烘箱溫度為65℃，烘至24 h以上，制成風(fēng)干樣品待用。飼料中水分、粗蛋白質(zhì)（CP）、粗纖維（CF），分 別 采 用GB/T 6435-2014、GB/T 6432-2018、GB/T 6434-2006的方法測定。總能（GE）使用能量測定儀測定。

1.3.2 pH、乳酸及揮發(fā)性脂肪酸 發(fā)酵結(jié)束后立即取適量樣品測定液體飼料中的pH、乳酸和揮發(fā)性脂肪酸含量。pH用pH計測定；乳酸含量的測定采用對羥基聯(lián)苯比色法；乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸含量的測定采用高效液相色譜測定。

1.3.3 活菌數(shù) 發(fā)酵結(jié)束后立即無菌移取適量液體飼料樣品，然后充分搖勻，用滅菌后的吸管吸取25 mL樣品放入裝有225 mL生理鹽水的無菌三角燒瓶中，三角燒瓶中放置適量的無菌玻璃珠，充分振蕩搖勻，制成1：10的樣品勻液，然后采用GB 4789.35-2010的方法測定乳酸菌活菌數(shù)，采用GB 4789.15-2016的方法測定酵母菌活菌數(shù)，采用GB/T 13091-2018的方法測定沙門氏菌活菌數(shù)，采用GB/T 18869-2019的方法測定大腸桿菌活菌數(shù)。

1.4 統(tǒng)計分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan’s 法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用“平均值與標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 對飼料中常規(guī)成分的影響 由表2可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，飼料中粗蛋白質(zhì)含量顯著提高（P＜0.05），粗纖維含量均無顯著變化（P＞0.05），總能顯著降低（P＜0.05）。

表2 不同發(fā)酵溫度對飼料中營養(yǎng)成分的影響（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

2.2 對pH、乳酸及揮發(fā)性脂肪酸的影響 由表3可知，隨著發(fā)酵溫度升高，液體飼料pH顯著下降，表明在適宜溫度條件下，溫度越高，產(chǎn)酸速度越快。25和30℃發(fā)酵時，液體飼料中乳酸的含量顯著高于20℃組（P＜0.05），但25和30℃之間差異不顯著（P＞0.05）；25和30℃發(fā)酵組的乙酸和丙酸含量顯著高于20℃發(fā)酵組（P＜0.05），而25和30℃發(fā)酵組之間的丙酸含量差異不顯著（P＞0.05），乙酸含量則25℃發(fā)酵組高于30℃發(fā)酵組（P＜0.05）。丁酸含量則隨發(fā)酵溫度的升高而顯著降低（P＜0.05）。

表3 不同發(fā)酵時間對飼料pH、乳酸及揮發(fā)性脂肪酸的影響

2.3 對活菌數(shù)的影響 由圖1可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，液體飼料中乳酸菌和酵母菌活菌數(shù)顯著升高（P＜0.05），其中25和30℃發(fā)酵組酵母菌活菌數(shù)無顯著差異。表明在20℃的發(fā)酵溫度下，乳酸菌和酵母菌的生長繁殖速度較25和30℃慢。不同發(fā)酵溫度下的液體飼料中均未檢出沙門氏菌和大腸桿菌。

圖1 不同發(fā)酵時間對飼料中乳酸菌活菌數(shù)的影響

3 討論

3.1 不同發(fā)酵溫度對液體發(fā)酵飼料中營養(yǎng)成分的影響 液體發(fā)酵飼料含水量高，飼料含水量通常在60%以上，更符合豬的消化生理特點(diǎn)，更易采食、消化和吸收。其發(fā)酵方式通常包括自然發(fā)酵、接種菌株發(fā)酵和保留式發(fā)酵等。本試驗(yàn)采用的是接種菌株發(fā)酵，接種的菌株包括植物乳桿菌和釀酒酵母菌等。厭氧條件下，植物乳桿菌可產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸，而釀酒酵母可產(chǎn)生二氧化碳和酒精等。試驗(yàn)使用植物乳桿菌和釀酒酵母為主的復(fù)合菌制劑，將含水量為60%的飼料置入帶有單向排氣閥的發(fā)酵瓶中，在不同溫度條件下發(fā)酵。結(jié)果表明，發(fā)酵溫度升高至25℃以上時，液發(fā)酵飼料的粗蛋白質(zhì)含量顯著增加（P＜0.05），總能顯著降低（P＜0.05），但粗纖維無顯著變化（P＞0.05）。總能顯著降低的原因可能是在發(fā)酵初期，釀酒酵母利用發(fā)酵瓶中殘余的氧氣進(jìn)行發(fā)酵，好氧發(fā)酵能快速消耗可溶性糖，轉(zhuǎn)化成二氧化碳和水。隨著發(fā)酵瓶中氧氣逐漸消耗，瓶中氣體則以二氧化碳等為主，進(jìn)而轉(zhuǎn)入無氧發(fā)酵。整個發(fā)酵過程，可溶性糖分被乳酸菌和酵母菌利用，造成干物質(zhì)部分損失，因此，總能顯著下降。而粗蛋白質(zhì)提高的原因一方面是發(fā)酵過程中乳酸菌和釀酒酵母利用飼料中的可溶性糖類用于自身生長帶來的干物質(zhì)損失（Canibe等，2012），間接導(dǎo)致粗蛋白質(zhì)含量升高，這種由于微生物發(fā)酵消耗部分原料，使產(chǎn)物總量減少，從而導(dǎo)致產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量的表觀值增加現(xiàn)象被稱之為“濃縮效應(yīng)”（張紅等，1996）。另一方面則是釀酒酵母本身含有大量蛋白質(zhì)，在適宜的發(fā)酵條件下，釀酒酵母大量增殖，引起飼料中粗蛋白質(zhì)的提高（張敏等，2010；尹瑋等，2008），接種乳酸菌的發(fā)酵液體飼料其粗蛋白質(zhì)含量會隨著接種時間的延長而增加（Montagne等，2003）。而粗纖維無顯著變化的原因則可能是植物乳桿菌和釀酒酵母菌產(chǎn)生纖維素酶的能力較枯草芽孢桿菌差，對粗纖維的分解能力不足。

3.2 不同發(fā)酵溫度對pH、乳酸和揮發(fā)性脂肪酸的影響 通常干飼料的pH接近7適宜病原微生物（如大腸桿菌、沙門氏菌等）的生長繁殖，而當(dāng)pH＜5時，病原微生物受到抑制，蛋白酶的活性最大。適宜條件下，發(fā)酵液體飼料通常可以在24 h內(nèi)使飼料pH降到4以下甚至更低，從而可抑制潛在病原微生物的滋生，提高飼料消化率。發(fā)酵溫度則是影響液體飼料pH的重要條件。適宜的發(fā)酵溫度可促進(jìn)液體飼料的發(fā)酵，也可減少在寒冷季節(jié)由于液體飼料溫度太低對豬造成的應(yīng)激。而受多種因素影響，目前尚沒有一個最佳發(fā)酵溫度。Jensen等（1998）研究了10～30℃不同溫度條件下對發(fā)酵效果的影響，結(jié)果表明，要使pH保持穩(wěn)定，溫度必須高于15℃，25～30℃效果會更好。在發(fā)酵起始期補(bǔ)充熱量是必要的（Brooks，1999）。本試驗(yàn)采用20、25和30℃三個發(fā)酵溫度，研究發(fā)現(xiàn)，與前人結(jié)果保持一致，在30℃的條件下，飼料pH最低，20℃時pH為5.85，表明在較低發(fā)酵溫度條件下乳酸菌活性較低，需要較長時間來進(jìn)行發(fā)酵和抑制其他微生物的生長繁殖（Wang，2013）。液體飼料中有機(jī)酸的種類及含量能影響液體飼料發(fā)酵品質(zhì)，其中乳酸和乙酸是液體發(fā)酵飼料中最主要的有機(jī)酸，是飼料pH下降的主要原因。通常情況下，乳酸含量高能提高液體發(fā)酵飼料的品質(zhì)。本試驗(yàn)中，隨著溫度升高，pH不斷下降，其他微生物活性受到抑制，乳酸菌成為優(yōu)勢菌群，使乳酸含量逐漸增加。

3.3 不同發(fā)酵溫度對液體發(fā)酵飼料活菌數(shù)的影響 環(huán)境溫度是影響微生物快速生長繁殖的重要因素之一。本研究結(jié)果顯示，隨著發(fā)酵溫度升高至25℃以上時，乳酸菌和酵母菌的活菌數(shù)顯著提高（P＜0.05）；而25和30℃的乳酸菌活菌數(shù)雖有顯著差異，但并無量級差別。試驗(yàn)所采用的植物乳桿菌最適生長溫度為30～35℃，釀酒酵母的最適生長溫度為20～30℃。因此，一般在最適宜的溫度范圍內(nèi)，溫度越高，越有利于微生物的生長繁殖以及液體飼料的發(fā)酵。Beal等（2002）發(fā)現(xiàn)，30℃時沙門氏菌的死亡速度是20℃時的4～5倍。同時，30℃的發(fā)酵溫度條件下，6～7 h后檢測不出沙門氏菌，而在20℃時，發(fā)酵24 h后還能檢出少量沙門氏菌（Fernandes等，1990）。本試驗(yàn)在不同溫度下發(fā)酵的液體飼料中均未檢出大腸桿菌和沙門氏菌，原因可能是植物乳桿菌和釀酒酵母菌產(chǎn)生的有機(jī)酸或抑菌產(chǎn)物對其進(jìn)行了抑制。

4 總結(jié)

在適宜生長范圍內(nèi)，提高植物乳桿菌和釀酒酵母的發(fā)酵溫度能顯著提高液體發(fā)酵飼料的粗蛋白質(zhì)含量，快速降低飼料pH，提高乳酸、乙酸等有機(jī)酸含量和有益菌活菌數(shù)，提高液體飼料品質(zhì)。但生產(chǎn)中維持較高發(fā)酵溫度需要消耗大量能源和成本，因此，25℃發(fā)酵更能應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。