CircPAPPA、miR-3127-5p表達與子癇前期妊娠結局的相關性分析

王小鳳，韓程成，康 瑛，賀同強，曹引麗

(西北婦女兒童醫院婦產科，陜西 西安 710061)

子癇前期(pre-eclampsia，PE)是一種妊娠特異性綜合征，全球發病率為4%～8%，主要發生在妊娠中后期，其特點是血壓升高并伴有蛋白尿、多器官并發癥，嚴重影響母嬰結局，是導致孕產婦和胎兒死亡的重要原因，具體發病原因尚不明確[1-2]。有研究認為PE的發生與滋養細胞侵襲力不足導致子宮螺旋動脈重鑄障礙有關[3]。環狀RNA(circular RNA，circRNA)可調控細胞增殖、遷移與侵襲等多種細胞功能，研究顯示，circRNA可調控胎盤滋養細胞侵襲及血管生成，參與PE的發生發展[4]。環狀RNA妊娠相關蛋白A(circular RNA pregnancy-associated plasma protein-A，CircPAPPA)屬于circRNA之一，CircPAPPA在PE患者胎盤與血漿中表達水平降低，下調CircPAPPA通過抑制滋養層細胞增殖促進PE的發生發展[5]。miR-3127-5p可調控腫瘤細胞增殖與遷移、上皮間質轉化及腫瘤耐藥，如在肝癌中，敲減miR-3127-5p可通過靶向調控細胞周期素依賴性激酶10(cyclin-dependent kinase 10，Cdk10)的表達抑制肝癌細胞侵襲及遷移[6]。通過starbase在線分析顯示，CircPAPPA、miR-3127-5p存在靶向結合位點，推測CircPAPPA、miR-3127-5p共同參與PE的發生發展。目前CircPAPPA、miR-3127-5p在PE的臨床研究報道不多，本研究探討CircPAPPA、miR-3127-5p在PE患者血清中的表達情況，探討二者與PE的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2020年6月至2022年3月在西北婦女兒童醫院產前檢查的93例PE孕婦為研究對象，作為PE組，年齡(27.35±5.76)歲；選擇同期健康孕婦90例作為對照組，年齡(26.87±5.81)歲。根據病情嚴重程度，將PE患者分為輕度組(53例)和重度組(40例)。納入標準：①符合PE診斷標準[7]；②自然妊娠且為單胎的孕婦；③年齡20～40歲；④有完整的產檢記錄。排除標準：①原發性高血壓、糖尿病、甲狀腺功能亢進等患者；②有精神疾病的患者；③心、肝、腎等主要臟器病變及感染性疾病、免疫系統疾病等；④胎兒畸形、胎盤早剝等其他產科并發癥。本研究經我院倫理委員會批準，患者均知情并同意。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集

記錄患者年齡、孕前身體質量指數(body mass index，BMI)、分娩孕周、孕次、產次等資料，測量收縮壓、舒張壓，收集24h尿液，采用雙縮脲法檢測24h尿蛋白。

1.2.2 血清CircPAPPA、miR-3127-5p的檢測

采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測血清CircPAPPA、miR-3127-5p表達水平。所有孕婦孕20～34周采集空腹靜脈血5mL，15 000rpm離心10min收集血清,-80℃保存。在血清中加入TRIzol試劑(百奧萊博，貨號：GL1311)提取總RNA，分光光度儀(賽默飛，型號NanoDrop 2000C)檢測RNA純度和濃度，按照逆轉錄試劑盒RT Master Mix for qPCR II(MCE，貨號：HY-K0510A)說明書合成cDNA，在CFX96熒光定量PCR儀(伯樂)上，使用SYBR Green qPCR Master Mix(MCE，貨號：HY-K0501A)試劑盒進行PCR反應。引物序列購自生工生物工程(上海)股份有限公司，其中CircPAPPA上游引物序列(5′-3′)：TGTGGCCTCCATCCTACATCTCAA；下游引物序列(5′-3′)：CAGGTGCGGACACTGGACTTAC。GAPDH上游引物序列(5′-3′)：TGACTTCAACAGCGACACCCA；下游引物序列(5′-3′)：CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA。miR-3127-5p上游引物序列(5′-3′)：ATCAGGGCTTGTGGAATGGG；下游引物序列(5′-3′)：GAACATGTCTGCGTATCTC。U6上游引物序列(5′-3′)：TGGCTCAACTACGATCGGCA；下游引物序列(5′-3′)：GGACTCACCGATGGTACAGA。實驗結束后，分別以GAPDH、U6為內參，采用2-△△Ct法計算CircPAPPA、miR-3127-5p的相對表達水平。

1.2.3 妊娠結局判斷

對所有PE孕婦進行隨訪，記錄不良妊娠結局，包括胎兒生長受限、新生兒死亡、早產、胎兒窘迫、新生兒窒息等。根據妊娠結局分為良好組(31例)和不良組(19例)。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 PE組與對照組一般資料比較

PE組與對照組的年齡、孕前BMI、孕次、產次比較差異均無統計學意義(P>0.05)，PE組剖宮產比例、舒張壓、收縮壓、24h尿蛋白顯著高于對照組，分娩孕周顯著低于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 PE組與對照組一般資料比較Table 1 Comparison of general data between the PE group and the control

2.2 PE組與對照組血清CircPAPPA、miR-3127-5p表達水平比較

與對照組比較，PE組患者血清CircPAPPA表達水平顯著降低，miR-3127-5p表達水平顯著升高(t值分別為10.862、15.749，P<0.05)，見表2。

表2 PE組與對照組血清CircPAPPA、miR-3127-5p表達水平比較Table 2 Comparison of serum CircPAPPA and miR-3127-5p expression levels between the PE group

2.3 不同嚴重程度PE患者血清CircPAPPA、miR-3127-5p表達水平及24h尿蛋白比較

與輕度組比較，重度組PE患者血清CircPAPPA表達水平顯著降低，miR-3127-5p表達水平、24h尿蛋白顯著升高(t值分別為7.774、9.652、18.493，P<0.05)，見表3。

表3 不同嚴重程度PE患者血清CircPAPPA、miR-3127-5p表達水平比較Table 3 Comparison of serum CircPAPPA and miR-3127-5p expression levels of PE patients with different

2.4 PE患者血清CircPAPPA、miR-3127-5p水平與臨床指標相關性

相關性分析顯示，PE患者的血清CircPAPPA、miR-3127-5p與年齡、BMI、孕周、生產方式、孕次、產次無關，CircPAPPA與舒張壓、收縮壓、24h尿蛋白呈負相關(P<0.05)，miR-3127-5p與舒張壓、收縮壓、24h尿蛋白呈正相關(P<0.05)，見表4。

表4 PE患者血清CircPAPPA、miR-3127-5p水平與臨床指標的相關性Table 4 Correlations between serum CircPAPPA, miR-3127-5p levels and clinical indicators in PE patients

2.5 PE患者血清CircPAPPA、miR-3127-5p表達水平相關性

PE患者血清CircPAPPA與miR-3127-5p表達水平呈負相關(r=-0.610，P<0.05)，見圖1。

圖1 PE患者血清CircPAPPA、miR-3127-5p表達水平相關性Fig.1 Correlation between expression levels of CircPAPPA and miR-3127-5p in serum of PE patients

2.6 不同妊娠結局孕婦血清CircPAPPA、miR-3127-5p表達水平比較

93例PE患者，有44例發生不良妊娠結局，其中生長受限20例，宮內窘迫12例，早產8例，死亡4例。與良好組比較，孕中、晚期不良妊娠結局孕婦血清CircPAPPA表達水平顯著降低，miR-3127-5p表達水平顯著升高(孕中期：t值分別為2.582、4.407；孕晚期：t值分別為6.095、6.501，P<0.05)，見表5、表6。

表5 孕中期不同妊娠結局孕婦血清CircPAPPA、 miR-3127-5p表達水平比較Table 5 Comparison of serum CircPAPPA and miR-3127-5p expression levels of pregnant women with different pregnancy outcomes in the second

表6 孕晚期不同妊娠結局孕婦血清CircPAPPA、miR-3127-5p表達水平比較Table 6 Comparison of serum CircPAPPA and miR-3127-5p expression levels of pregnant women with different pregnancy outcomes in the third

3 討論

3.1 PE發病的可能影響因素

PE特發于妊娠期婦女，可導致孕婦出現高血壓、水腫和蛋白尿等癥狀，嚴重者可引發子癇、心臟衰竭等各種并發癥，并引起胎兒生長受限，是導致孕產婦及胎兒死亡的主要原因，早期診斷及加強早期治療具有重要意義[8]。非編碼RNA(miRNA、circRNA、lncRNA)在血清、血漿中表達穩定，多項研究報道顯示，PE患者外周血miRNA、circRNA表達譜與健康人群有差異，通過檢測血液中非編碼RNA可判斷疾病的發生、病情與預后[9]。

3.2 CircPAPPA與PE的相關性

CircRNA通過調節基因表達和轉錄調控細胞增殖、侵襲及血管生成，參與多種疾病病理過程，如妊娠期高血壓、糖尿病、PE等多種妊娠期并發癥的發生與發展，已有報道顯示，CircRNA在PE患者外周血異常表達，成為PE診斷及病情評估的標志物[10]。CircPAPPA是妊娠相關蛋白A的環狀RNA，PAPP-A是孕早期唐氏篩查的參考指標，主要由胎盤絨毛膜滋養層細胞產生，通過調節胰島素樣生長因子(insulin like growth factor，IGF)的活性影響胎盤的發育，PAPP-A在PE中表達水平降低，預測PE發生的敏感度較低[11]。本研究結果顯示，PE患者血清中CircPAPPA表達水平顯著降低，且重度組PE患者的血清CircPAPPA表達水平顯著低于輕度患者，提示CircPAPPA可能參與PE的發生，與PE患者病情嚴重程度有關。

3.3 miR-3127-5與PE的相關性

circRNA可充當miRNA的海綿分子調控基因表達而參與疾病進展，miR-3127-5p屬于miRNA，在腫瘤領域研究的較多，miR-3127-5p在結直腸癌、宮頸癌中下調表達，過表達miR-3127-5p可抑制腫瘤細胞的遷移、侵襲和上皮間質轉化過程[12]。另有研究顯示，miR-3127-5p可參與調節血管平滑肌細胞功能而參與腹主動脈瘤的發病機制[13]。本研究結果顯示，miR-3127-5p在PE患者血清中表達水平顯著升高，且輕度PE患者、重度PE患者血清miR-3127-5p表達水平依次升高，提示其可能與PE病情嚴重程度有關。

3.4 CircPAPPA、miR-3127-5與PE妊娠結局的相關性

相關性分析顯示，PE患者CircPAPPA與舒張壓、收縮壓、24h尿蛋白呈負相關，miR-3127-5p與舒張壓、收縮壓、24h尿蛋白呈正相關，進一步提示CircPAPPA、miR-3127-5p與PE患者病情嚴重程度相關。PE的發病機制尚不完全清楚，多數研究認為PE的發生與滋養細胞浸潤子宮螺旋動脈過淺有關[14]。Li等[15]研究顯示，circPAPPA通過調控miR-3127-5p表達抑制同源框A7(homeobox A7，HOXA7)表達調節滋養層細胞的增殖、遷移和侵襲，介導PE的進展。本研究顯示，PE患者血清CircPAPPA、miR-3127-5p表達水平呈負相關，且通過starbase在線分析顯示，CircPAPPA、miR-3127-5p存在靶向結合位點，證實CircPAPPA可靶向負調控miR-3127-5p表達，因此推測CircPAPPA通過靶向調控miR-3127-5p表達，抑制滋養細胞增殖與侵襲，導致子宮螺旋動脈重鑄障礙，血管重塑障礙，促進PE的發生發展。PE是造成不良母嬰結局的重要疾病之一，本研究顯示，孕中期、孕晚期不良妊娠結局孕婦血清CircPAPPA表達水平顯著低于良好組，miR-3127-5p表達水平顯著高于良好組，提示CircPAPPA、miR-3127-5p與PE妊娠結局相關。CircPAPPA水平降低，miR-3127-5p水平升高，可能通過影響滋養細胞浸潤加重PE病情，進而影響妊娠結局。

綜上所述，PE患者血清CircPAPPA表達水平降低，miR-3127-5p表達水平升高，且與PE病情嚴重程度及妊娠結局相關，有一定臨床應用價值，但其具體作用機制仍需做進一步研究。