在線固相萃取/二維液相色譜法同時測定嬰幼兒配方奶粉中多種脂溶性維生素

毛燕妮，許晴，李宏銓，聶懿，朱靜璇，柳慧冰，康翠欣*

1(武漢食品化妝品檢驗所，湖北 武漢，430040)2(國家市場監管重點實驗室(食用油質量與安全)，湖北 武漢，430040)

維生素是為維持人體正常代謝和生理功能而必須從食物中獲得的一類非常重要的有機化合物，分為脂溶性維生素和水溶性維生素兩大類[1-2]。其中脂溶性維生素主要包括維生素A、D、E、K1，是嬰幼兒生長發育的必需營養素，但其添加量必須控制在一定范圍，如果缺乏或攝入過量都會引起代謝失衡，造成健康問題[1-2]。由于嬰幼兒食物來源單一，乳粉中維生素的含量直接影響嬰幼兒的健康。因此，快速、準確檢測嬰幼兒配方奶粉中脂溶性維生素的含量極其重要。

目前，脂溶性維生素A、D、E、K1通常采用高效液相色譜法進行檢測，由于嬰幼兒配方奶粉中維生素A、E、K1、D的含量存在從納克級到毫克級不同含量水平，并且基質復雜，使得其無法共同提取和分析。現行國家標準方法GB 5009.82—2016《食品安全國家標準 食品中維生素A、D、E的測定》和文獻報道測定維生素A、D、E方法多采用長時間堿性皂化破壁、多次液液萃取凈化、濃縮的前處理方式[3-8]，且維生素D需要正相高效液相色譜半制備分離濃縮后由反相高效液相色譜儀檢測，操作繁瑣、費時，重復性差。現行國家標準方法GB 5009.158—2016《食品安全國家標準 食品中維生素K1的測定》和文獻報道測定維生素K1方法多采用酶解、液液萃取、濃縮的前處理方式，柱后鋅粉還原-高效液相色譜-熒光檢測法進行檢測分析[9-15]。由于嬰幼兒配方奶粉基質復雜、維生素含量差別大且測定靈敏度低等原因，同時測定脂溶性維生素A、D、E、K1的檢測方法鮮有報道。

在線固相萃取/二維液相色譜法是將分離機制不同的2根色譜柱串聯起來構成的分離系統，通過濃縮、捕集和切割后，在一維中不能完全分離的組分則可以在第二維中得到更好的分離，從而實現樣品的在線凈化，可以提高分析靈敏度[16-19]。已有文獻報道，利用在線固相萃取/二維液相色譜法同時測定脂溶性維生素的方法，僅測定維生素A、維生素D、α-維生素E、γ-維生素E、δ-維生素E，未測定β-維生素E、維生素K1。本文中樣品經皂化后，利用在線固相萃取技術與二維液相色譜技術的聯用，同時測定嬰幼兒配方奶粉中維生素A、維生素D2、維生素D3、α-維生素E、β-維生素E、γ-維生素E、δ-維生素E和維生素K1，直接進樣分析，大大提高了檢測效率。該方法回收率高、靈敏度高、重現性好。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

維生素A(99.4%)，SIGMA公司；維生素D2(99.6%)、維生素D3(99.6%)、維生素K1(99.29%)，英國LGC；α-維生素E(98%)、β-維生素E(98%)、δ-維生素E(98%)、γ-維生素E(98%)，美國TLC公司；甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚、無水乙醇(色譜純)，德國默克公司；氫氧化鉀、抗壞血酸(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

1260二維液相色譜儀：配有2個四元泵、1個二元泵、3個六通閥、1個紫外檢測器(VWD)、1個二極管陣列檢測器(DAD HS)、1個柱溫箱、1個自動進樣器，美國安捷倫公司；ME204天平，美國梅特勒-特利多儀器有限公司；Milli-Q超純水儀，美國密理博公司；水浴恒溫振蕩器，中國常州國華電器有限公司；X-15冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特公司；UV-1800紫外可見分光光度計，日本島津公司；Poroshell 120 PFP色譜柱(4.6 mm×100 mm, 4 μm)、Eclipse PAH色譜柱(2.1 mm×100 mm, 3.5 μm)、Poroshell 120 EC-C18色譜柱(4.6 mm×5 mm, 4 μm)、ONLINE PLRP-S固相萃取柱(4.6 mm×12.5 mm, 15 μm～20 μm)，美國安捷倫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液配制

分別取維生素A、維生素D2、維生素D3、α-維生素E、β-維生素E、δ-維生素E、γ-維生素E和維生素K1各10 mg于10 mL棕色容量瓶中，無水乙醇溶解并定容，再分別用無水乙醇稀釋，紫外可見分光光度計對其進行濃度校正。用V(乙醇)∶V(水)=1∶1稀釋并定容至刻度配制混合標準曲線，各種維生素的濃度梯度見表1。

表1 維生素A、維生素D2、維生素D3、α-維生素E、β-維生素E、δ-維生素E、γ-維生素E和維生素K1曲線濃度

1.3.2 試劑配制

氫氧化鉀溶液：稱取氫氧化鉀50 g，加入40 mL水溶解，混勻。

1.3.3 樣品前處理

稱取5 g樣品，加入20 mL 40～60 ℃溫水，混勻；再加入1.0 g抗壞血酸，混勻。分別加入30 mL無水乙醇和15 mL氫氧化鉀溶液，邊加邊振搖，充分混勻后于80 ℃恒溫水浴震蕩皂化15 min。皂化后立即用冷水冷卻至室溫，用V(乙醇)∶V(水)=1∶1溶液轉移并定容至100 mL棕色容量瓶中，混勻。取適量上述溶液，10 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm有機系濾膜，待測。

1.4 儀器分析條件

色譜柱：Poroshell 120 PFP柱為一維分析柱，Eclipse PAH柱為二維分析柱，Poroshell 120 EC-C18柱為捕獲柱，ONLINE PLRP-S固相萃取柱為皂化液凈化柱。進樣量：100 μL。柱溫：30 ℃。檢測波長：VWD(一維)：0～14 min：325 nm、14～17 min：264 nm、17～28 min：294 nm；DAD(二維)：0～24 min：264 nm、24～28 min：248 nm。流速：SPE泵：1.0 mL/min；一維泵：0～6.5 min：0.5 mL/min、6.5～22 min：1.0 mL/min、22～28 min：0.5 mL/min；二維泵：0.4 mL/min。流動相：SPE泵：A：水；B：乙腈；C：甲醇；D：甲基叔丁基醚；一維泵：A：水；B：甲醇；二維泵：A：乙腈；B：甲醇，洗脫程序見表2。流路連接示意圖見圖1，閥A切換時間：0～4.5 min(位置1-6)，4.5～5.9 min(位置1-2)，5.9～28 min(位置1-6)，閥B切換時間：0～15.7 min(位置1-6)，15.7～16.5 min(位置1-2)，16.5～19.7 min(位置1-6)，19.7～20.7 min(位置1-2)，20.7～28 min(位置1-6)。

表2 流動相洗脫程序

圖1 流路連接示意圖

2 結果與分析

2.1 儀器方法的建立

2.1.1 色譜柱的選擇

為了使4種維生素E的異構體能夠得到有效的分離，一維色譜柱分別比較了Poroshell 120 PFP柱、EC-C8柱和Poroshell 120 EC-C18柱。其中Poroshell 120 PFP柱能較好分離4種維生素E，其他色譜柱不能將β-維生素E、γ-維生素E有效分離。而為了使維生素D2和維生素D3能夠有效分離，二維色譜柱又比較了Eclipse PAH柱和Poroshell 120 EC-C18柱，Eclipse PAH柱能夠有效分離維生素D2和維生素D3。因此選擇Poroshell 120 PFP柱和Eclipse PAH柱分別作為一維和二維色譜柱。

2.1.2 色譜條件的優化

構建在線固相萃取/二維液相色譜法，關鍵的色譜條件體現在以下3點：

(1)利用在線固相萃取裝置去除皂化液中的強堿、較強極性和強極性物質。通過閥A在位置1-6及SPE泵的初始流動相[V(甲醇)∶V(水)=8∶2]將目標物保留在SPE柱上，除掉大部分強堿和極性強的物質，當閥A切換為位置1-2，實現一維泵初始流動相[V(甲醇)∶V(水)=3∶7]對SPE柱的反沖，將目標物洗脫至一維色譜系統，再將閥A切換回位置1-6，再生SPE柱。

(2)由于嬰幼兒配方奶粉中維生素A和維生素E含量較高,維生素D和維生素K1含量較低，故需要在一維上將維生素A和4種維生素E進行分離，并且將維生素D和維生素K1通過閥B切換到捕獲柱上，通過靈敏度更高的檢測器即二維進行分析。采用先將濃度較高的維生素A、α-維生素E、β-維生素E、δ-維生素E、γ-維生素E在一維色譜系統上進行分離，同時確定維生素D2、維生素D3和維生素K1在一維檢測器的保留時間，再將閥B在維生素D2、維生素D3和維生素K1出峰的時間段從位置1-6切換至1-2，使目標物保留在捕集柱上，最后通過二維液相色譜的流動相將目標物洗脫，在二維檢測器上進行測定。

(3)二維色譜系統上需要將維生素D2和維生素D3進行有效分離，并且選擇合適的流動相條件測定維生素K1。一維和二維色譜圖見圖2。

a-一維液相色譜圖；b-二維液相色譜圖

2.2 前處理條件的選擇

樣品前處理的過程參照GB 5009.82—2016中的皂化過程，為防止維生素變性，在充分討論了抗壞血酸添加量的基礎上，沿用上述食品安全國家標準中1.0 g抗壞血酸的加入量，但不再加入2,6-二叔丁基對甲酚。通過持續一周對樣品溶液中各維生素的含量進行測定，結果發現樣品溶液保存在-18 ℃條件下，維生素含量基本保持穩定。此外對于氫氧化鉀溶液的加入量，發現加入10～20 mL時各維生素的含量無明顯變化。為了保證皂化反應完全以及在線固相萃取柱除堿效率最大化，選擇加入15 mL氫氧化鉀溶液。另外考察了溫度對皂化效率以及維生素分解的影響，發現80 ℃水浴15 min能使樣品皂化完全且維生素A、維生素D2、維生素D3、α-維生素E、β-維生素E、δ-維生素E、γ-維生素E和維生素K1均未發生變性、分解的情況。此外，還比較了定容溶劑，發現純乙醇定容時儀器響應高，但峰面積、保留時間不穩定，而用V(乙醇)∶V(水)=1∶1定容時所測定的各種脂溶性維生素能維持較好的穩定性，所以最后采用V(乙醇)∶V(水)=1∶1對皂化液進行定容。

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性范圍

按照1.3.1配制標準儲備溶液及標準曲線，進樣量100 μL，對各濃度梯度下維生素A、維生素D2、維生素D3、α-維生素E、β-維生素E、δ-維生素E、γ-維生素E、維生素K1進行測定。維生素A在2～500 ng/mL相關系數0.999 9，維生素D2在0.5～125 ng/mL相關系數0.998 9，維生素D3在0.5～125 ng/mL相關系數0.999 1，α-維生素E在20～5 000 ng/mL相關系數0.999 4，β-維生素E在20～5 000 ng/mL相關系數0.999 3，δ-維生素E在20～5 000 ng/mL相關系數0.999 0，γ-維生素E在20～5 000 ng/mL相關系數0.998 5，維生素K1在2～500 ng/mL相關系數0.998 4，表明各目標物在一定的濃度范圍內線性關系良好。

2.3.2 方法檢出限及方法定量限

分別根據S/N=3和S/N=10確定各種脂溶性維生素的檢出限和定量限，維生素A、維生素D2、維生素D3、α-維生素E、β-維生素E、δ-維生素E、γ-維生素E和維生素K1檢出限分別為4.0、1.0、1.0、40.0、40.0、40.0、40.0、4.0 μg/100 g；定量限分別為10.0、2.5、2.5、100.0、100.0、100.0、100.0、10.0 μg/100 g，均能滿足嬰幼兒配方奶粉的檢測要求，與GB 5009.82—2016第一法和第四法、GB 5009.158—2016第一法中的檢出限和定量限相近。

2.3.3 準確度和精密度

對空白樣(乳清蛋白粉)進行加標回收實驗，按定量限、2倍定量限和10倍定量限3種濃度水平制備加標回收樣品，按照上述實驗操作進行6平行實驗，得到維生素A、維生素D2、維生素D3、α-維生素E、β-維生素E、δ-維生素E、γ-維生素E和維生素K1加標回收率在91.23%～107.2%，相對標準偏差在0.67%～8.06%。該方法的準確度和精密度較好，可以滿足實驗需求。

2.3.4 Fapas能力驗證結果及與食品安全國家標準方法結果的比較

參加了2021年度嬰幼兒配方奶粉中維生素A、維生素D3、α-維生素E和維生素K1的Fapas能力驗證，采用在線固相萃取/二維液相色譜法對維生素A、維生素D3、α-維生素E和維生素K1進行測定，結果均滿意，z值分別為0.4、0.3、0.2和1.1，均在允許誤差范圍內。將本方法與GB 5009.82—2016第一法、第四法和GB 5009.158—2016第一法檢測結果分別進行比較，實驗結果表明，本方法測定結果更接近指示值，詳見表3，且前處理步驟簡單，一方面省去了食品安全國家標準中液液萃取等繁瑣步驟，耗時短、消耗溶劑少、準確度和穩定性高；另一方面降低了檢測和人工成本，并且可實現批量同時檢測嬰幼兒配方奶粉中維生素A、維生素D2、維生素D3、α-維生素E、β-維生素E、δ-維生素E、γ-維生素E和維生素K1。

表3 Fapas樣品中維生素A、維生素D3、α-維生素E 和維生素K1的測定結果

2.3.5 實際樣品檢測

隨機選取11批次市售嬰幼兒配方奶粉，按照1.3進行檢測，結果見表4。測定結果均符合食品安全國家標準相關限量規定。

表4 實際樣品中維生素A、維生素D3、α-維生素E和維生素K1測定結果

3 結論

本方法建立了在線固相萃取/二維液相色譜的方法，用于同時測定嬰幼兒配方奶粉中多種脂溶性維生素，大大提高了檢測效率，方法學驗證結果較好。該方法能同時滿足食品安全國家標準3個方法的檢測要求，為嬰幼兒配方奶粉中脂溶性維生素的檢測方法提供了新的思路。