超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測模式測定葡萄酒中41種農(nóng)藥和7種真菌毒素殘留

周春紅，彭文靜

1(甘肅省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州，730000)2(蘭州市農(nóng)業(yè)科技研究推廣中心，甘肅 蘭州，730000)

葡萄酒酒精度較低，口感醇厚愉悅，香氣優(yōu)雅和諧，含有多種營養(yǎng)成分，隨著經(jīng)濟(jì)的快速增長，受到越來越多消費(fèi)者的喜歡。

農(nóng)藥可以對真菌、蟲草等有害生物進(jìn)行防治，部分農(nóng)藥可以有效的控制植物生長，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。規(guī)范合理的施用農(nóng)藥，可以使農(nóng)產(chǎn)品高產(chǎn)、高質(zhì)量，然而不合理的施用易導(dǎo)致食品中殘留農(nóng)藥。少量農(nóng)藥在人體內(nèi)殘留不會(huì)立即產(chǎn)生危害，但是化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定的農(nóng)藥在人體內(nèi)長時(shí)間蓄積會(huì)對人體造成傷害[1]。同時(shí)，農(nóng)藥通過影響葡萄酒中的酚類物質(zhì)，影響酒的色澤、香氣等[2]。為保證葡萄的質(zhì)量和產(chǎn)量，葡萄在栽培過程中易使用防病蟲害的農(nóng)藥，這些農(nóng)藥可殘留在葡萄表皮并伴隨著發(fā)酵過程轉(zhuǎn)移到葡萄酒中[3-6]。因此，葡萄酒中的農(nóng)藥殘留問題已引起生產(chǎn)者和消費(fèi)者的廣泛關(guān)注[7]。

QuEChERS法[8]可同時(shí)分析農(nóng)殘、真菌毒素等多種化合物，主要包括萃取、鹽析、凈化3部分。與傳統(tǒng)前處理方法相比，具有快速、試劑耗材損耗少、可同時(shí)提取多種組分等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于復(fù)雜基質(zhì)樣品中的多種組分的同時(shí)提取、凈化[9-10]。葡萄酒中農(nóng)藥殘留和真菌毒素殘留檢測需要較高的靈敏度，目前蔬菜、水果等不同基質(zhì)中農(nóng)藥殘留和真菌毒素常用的方法有LC-MS/MS[11-14]、GC-MS[15]、GC[16]等。LC-MS/MS法可測定不易揮發(fā)或高溫易分解的化合物，適用于分析復(fù)雜基質(zhì)樣品，具有高靈敏度、耗時(shí)短、同時(shí)檢測多種組分等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于葡萄酒中農(nóng)殘和真菌毒素污染分析。目前，針對葡萄酒中農(nóng)藥殘留和真菌毒素的檢測方法及限量還沒有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行規(guī)范，關(guān)于利用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法檢測葡萄酒中農(nóng)藥和真菌毒素殘留也鮮見報(bào)道。因此，對葡萄酒中多種有毒有害物質(zhì)殘留量進(jìn)行有效監(jiān)控，建立一種簡單、高效的高通量篩查方法是十分迫切的。

本文選擇了52種較常見的農(nóng)藥和8種易污染的真菌毒素作為研究對象，以葡萄酒為研究基質(zhì)，運(yùn)用QuEChERS結(jié)合超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法(ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，UPLC-MS/MS)建立快速測定葡萄酒中多種農(nóng)藥殘留和真菌毒素殘留的檢測方法，提高檢測效率，以期為建立系統(tǒng)的檢測分析葡萄酒中多種農(nóng)藥殘留和真菌毒素殘留相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)支持，為葡萄酒安全和提高葡萄酒產(chǎn)品品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)，為市場監(jiān)管葡萄酒品質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)評估提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄酒樣品購于超市。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：60種待測物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品信息詳見附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ&dbname=CAPJLAST&filename=SPFX2022061400D)，天津阿爾塔公司；甲醇、乙腈(均為色譜純)，德國Meker公司；乙酸銨、甲酸(色譜純)，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；QuEChERs鹽包、凈化粉，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QTRAP 4500 UPLC-MS/MS，美國SCIEX公司；VXR渦旋振蕩器，德國IKA公司；KH30R-Ⅱ高速冷凍離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；KQ-600DE超聲波清洗器，東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司；十萬分之一天平(精密度為0.01 mg)，Sartorius公司；Milli-Q Gradient純水儀，美國Millipore公司；TLE204E分析天平(精密度為0.000 1 g)，梅特勒公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

Waters Acquity UPLC T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流速0.2 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量 5 μL；流動(dòng)相：A為乙腈水溶液(含5 mmol/L乙酸銨)，B為乙腈；流動(dòng)相梯度洗脫程序：0～3.0 min，5%～30% B；3.0～4.0 min，30%～40% B；4.0～6.0 min，40%～95% B；6.0～8.0 min，95% B；8.0～8.2 min，95%～5% B；8.2～12 min，5% B。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源：ESI；檢測方式：MRM模式；氣簾氣0.24 MPa；碰撞氣：medium；離子化電壓5 500 V；離子源溫度550 ℃；噴霧氣0.38 MPa；輔助加熱器0.41 MPa。60種目標(biāo)化合物在MRM模式下的質(zhì)譜條件具體見附表1。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

農(nóng)殘混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制(10 μg/mL)：分別準(zhǔn)確稱取各對照品10 mg于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成母液(附表1)。分別移取母液各100 μL于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃下密封保存。

真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制(1 μg/mL)：分別準(zhǔn)確移取4種黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2)500 μL、玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL、赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL于5 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于-18 ℃下密封保存。

溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確移取適量的農(nóng)殘混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用20%(體積分?jǐn)?shù))乙腈水溶液配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

空白葡萄酒基質(zhì)溶液：稱取陰性葡萄酒樣品經(jīng)1.3.4提取、凈化處理后于4 ℃下條件下貯存?zhèn)溆谩?/p>

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確移取適量的農(nóng)殘混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用空白葡萄酒基質(zhì)溶液配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取10 g(精確到0.1 mg)葡萄酒樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋混勻1 min，加入QuEChERs鹽包(4 g MgSO4，1 g NaC1，0.5 g檸檬酸氫二鈉,1 g檸檬酸鈉)，加入1顆陶瓷均質(zhì)子，劇烈振蕩1 min 后4 000 r/min離心5 min；移取7 mL上清液至凈化管中(150 mg MgSO4, 50 mg C18, 50 mg乙二胺-N-丙基硅烷)，渦旋混勻1 min，4 000 r/min離心5 min，吸取上清液過0.22 μm濾膜后，待UPLC-MS/MS分析。

1.3.5 方法學(xué)考察

1.3.5.1 基質(zhì)效應(yīng)、線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)及檢出限

1.3.3中配制好的溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液按照1.3.1 和1.3.2色譜及質(zhì)譜條件直接進(jìn)樣測定，以對照品濃度為橫坐標(biāo)(x)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到48種待測物質(zhì)的線性方程、相關(guān)系數(shù)，通過基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比來考察48種待測物質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)。采用陰性葡萄酒樣品加標(biāo)方式考察48種待測物質(zhì)的檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)。

1.3.5.2 精密度和加標(biāo)回收試驗(yàn)

在陰性葡萄酒樣品中添加25、50、80 μg/kg 3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)加標(biāo)水平做6次平行實(shí)驗(yàn)，采用優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測定，計(jì)算低、中、高3個(gè)添加水平的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MRM模式下農(nóng)藥殘留和真菌毒素殘留檢測方法的建立

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

運(yùn)用質(zhì)譜進(jìn)行分析時(shí)，化合物的母離子、子離子、去簇電壓、碰撞能量需要優(yōu)化。本研究在國家標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)報(bào)道[7-14]的基礎(chǔ)上，采用Scan模式掃描確定母離子、子離子，在MRM模式下找出48種目標(biāo)化合物的特征子離子碎片，并優(yōu)化DP和碰撞能量使各離子碎片的響應(yīng)值達(dá)到最優(yōu)，優(yōu)化后的質(zhì)譜條件如附表1所示。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

不同類型藥物的極性差異較大，流動(dòng)相的組成不僅影響目標(biāo)化合物的峰形，還影響目標(biāo)化合物的離子化效應(yīng)。本研究考察了乙腈+水、0.1%甲酸乙腈+0.1%甲酸水溶液、乙腈+水溶液(含5 mmol/L乙酸銨)、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸銨)4種流動(dòng)相體系的分離效果。結(jié)果顯示0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸銨)作為流動(dòng)相時(shí)各化合物的峰型較好，60種待測物質(zhì)的MRM總離子流圖如附圖1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ&dbname=CAPJLAST&filename=SPFX2022061400D)所示，因此選擇0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸銨)為流動(dòng)相進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(matrix effects，ME)是指葡萄酒中脂肪酸、糖、醇等在質(zhì)譜離子化的過程中增強(qiáng)或減弱待測物質(zhì)的響應(yīng)[15]。若ME<1時(shí)，表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng)；ME=1時(shí)，表示不存在基質(zhì)抑制效應(yīng)；ME>1時(shí)，表示存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。結(jié)果表明，10%藥物的ME<0.8%，呈現(xiàn)為基質(zhì)抑制作用；47.5%藥物的ME為0.8%～1.2%，基質(zhì)效應(yīng)相對不明顯；42.5%藥物的ME>1.2%，呈現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)作用。因此，本實(shí)驗(yàn)采用空白葡萄酒基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，降低待測物質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)影響。

2.2.2 線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)及檢出限

由附表2(https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ & dbname=CAPJLAST & filename=SPFX2022061400D)可知，41種農(nóng)藥和7種真菌毒素在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)≥0.999 01。采用陰性葡萄酒樣品加標(biāo)方式考察48種待測藥物的檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)，檢出限為0.01～5 μg/kg，定量限為0.05～17 μg/kg。

2.2.3 回收率和精密度

在陰性葡萄酒樣品中添加低、中、高3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)加標(biāo)水平測定6次，加標(biāo)回收率及精密度結(jié)果如附表3(https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CAPJ&dbname=CAPJLAST&filename=SPFX2022061400D)所示。其中48種待測物質(zhì)的加標(biāo)回收率為79.6%～122.5%，RSD為0.21%～6.39%。

2.2.4 實(shí)際樣品的測定

采用建立的方法測定了15批次市售葡萄酒樣品中41種農(nóng)藥和7種真菌毒素殘留，其中15批次樣品均未檢出真菌毒素殘留，2批次樣品中未檢出農(nóng)藥殘留，其他13批次樣品單批樣本中檢出藥物種類2～6種，共檢出藥物9種(表1)，分別為烯酰嗎啉、多菌靈、噻蟲嗪、戊唑醇、嘧菌酯、霜霉威、甲霜靈、腈菌唑、甲萘威。所有樣品中檢出烯酰嗎啉的含量為1.0～57.1 μg/kg，多菌靈的含量為10.6～62.4 μg/kg、噻蟲嗪的含量為0.5～2.1 μg/kg、戊唑醇的含量為4.6～39.4 μg/kg、嘧菌酯的含量為2.2～3.7 μg/kg、霜霉威的含量為0.3～37.8 μg/kg、甲霜靈的含量為0.9～32.7 μg/kg、腈菌唑的含量為1.4～6.8 μg/kg，樣品中均未檢出克百威。其中多菌靈、甲霜靈及克百威結(jié)果符合NY/T 274—2014的標(biāo)準(zhǔn)要求。

表1 葡萄酒樣品中藥物的含量 單位：μg/kg

在檢測的15批次樣品中，烯酰嗎啉、甲霜靈、多菌靈、霜霉威檢出率較高。相關(guān)研究表明，葡萄種植過程中霜霉病在葡萄生長后期易發(fā)病且周期較長，烯酰嗎啉、霜霉威可較好的抑制霜霉病菌的孢子囊萌發(fā)，可以有效防治葡萄的霜霉病[16-17]；甲霜靈、多菌靈、嘧菌酯等易檢出農(nóng)藥可有效防治軸枯病、灰霉病、炭疽病等常見的病蟲害[18-20]。由此可知，葡萄的種植過程中農(nóng)藥使用情況普遍存在且檢出率較高，建議在葡萄的種植過程中規(guī)范栽培管理，重視農(nóng)藥的劑量使用。

3 結(jié)論

本文利用液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜MRM模式，建立了葡萄酒中41種農(nóng)藥殘留和7種真菌毒素殘留的高通量檢測方法。48種待測物質(zhì)中線性良好，檢出限為0.01～5 μg/kg，定量限為0.05～17 μg/kg，加標(biāo)回收率為79.6%～122.5%，RSD為0.21%～6.39%。該方法操作簡便、快速簡單，可同時(shí)分析葡萄酒中48種化合物，滿足葡萄酒中農(nóng)藥和真菌毒素殘留的快速篩查和定量檢測，為今后制定相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)提供方法依據(jù)。