超高效液相色譜法定量檢測干果中20種酸性染料

楊濤，劉俊，劉衛國*，粟有志，常要寶，毛雨晴

1(新疆大學 生態與環境學院，新疆 烏魯木齊，830017)2(綠洲生態教育部重點實驗室，新疆 烏魯木齊，830017)3(成都海關技術中心，四川 成都，610041)4(伊寧海關技術中心，新疆 伊寧，835099)

色彩鮮艷的食品往往能在外觀上吸引消費者和提高消費者對食品的信賴感[1]。因此，不法商販將價格更低廉的合成染料添加到食品和藥品中以增強競爭力。其中，酸性染料因其價格便宜、色牢度強，也被使用在食品中。酸性染料一般為含磺酸基偶氮染料，在酸性條件下可對蛋白質纖維染色。據報道，合成染料在食品中過度使用會引起人體的興奮和過敏反應[2-3]。為了加強食品安全，許多國家頒布了不同的規章制度來限制合成染料在食品中可以使用的種類和劑量，如歐洲委員會頒布的關于食品接觸塑料著色劑使用的決議AP(89)1以及中國政府頒布的GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》。在規定中，食品均禁止使用酸性染料。不法商家在食品中使用酸性染料將嚴重威脅人類的健康安全。

我國針對食品添加劑的測定出臺了GB/T 5009.35—2016《食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定》對部分染料檢測的方法，也有很多學者對其進行了進一步研究。文獻中合成染料的分析方法有伏安法[4]、光譜法[5]、薄層色譜法(thin-layer chromatography，TLC)[6]、極譜法[7]、毛細管電泳法(capillary electrophoresis，CE)[8]、HPLC法。其中最常用的方法是HPLC。FENG等[9]改良了一種HPLC-MS/MS，該方法可以同時檢測40種合成染料。BONNAN等[10]優化的高效液相色譜法串聯二極管陣列檢測器(HPLC-diode array detector，HPLC-DAD)對樣品進行檢測，該方法能同時檢測飲料中的17種合成染料。據報道[11-12]，HPLC-MS/MS系統具有極高的靈敏度和準確性，但是由于價格高昂、操作復雜。HPLC-DAD系統則可以兼顧靈敏度和成本之間的沖突，而在處理基質較為復雜的樣品時，往往表現出色譜分離性較差的現象。

隨著HPLC技術的發展，食品中染料檢測技術已經應用在了水、飲料以及辣椒制品等產品中[13-15]，但對于干果這類機制較為復雜的食品報道較少。部分食品中的凝膠、脂質會干擾色譜柱，因此在測定含有復雜基質的食品時，HPLC方法的靈敏度很差[16]。含有高油脂、高凝膠的干果等食品通過適當的前處理程序減少基質效應對測定結果的影響，是一個研究的方向。目前，常見的食品前處理方法有膜過濾法[17-18]、固相萃取法[10,19]、凝膠色譜柱凈化法(gel permeation chromatography，GPC)[20]、液相萃取法[21-22]等。在萃取時也通常采用超聲波及微波來輔助提取[23]。

在本研究中，對提取試劑進行了優化，并采用GPC對提取液進一步凈化，通過對20種目的酸性染料光譜特性的分析，確定最佳檢測波長。在實際樣品檢測中被證實，一種依托于UPLC-DAD的分析方法被提出，它可以高效、快速地測定干果中的20種酸性染料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞、葡萄干均采購于新疆烏魯木齊當地農產品市場；20種酸性染料標準品：酸性黃23、酸性紅18、酸性紫7、酸性橙10、酸性紅35、酸性紅14、酸性綠5、酸性紅73、酸性黑1、酸性橙7、酸性黑24、酸性橙56、酸性紫43、酸性紫17、酸性藍62、酸性藍7、酸性黃151、酸性黃79、酸性棕282、酸性綠73(純度>98%)，德國Dr Ehrenstorfer公司。分別稱取20種酸性染料標準品，用超純水稀釋至1 000 μg/mL標準儲備液，使用前再逐級稀釋；乙腈(色譜純)，Fisher公司；乙酸(分析純)，西安化學試劑廠；乙酸銨、乙酸乙酯(色譜純)，德國Merck公司。

1.2 儀器與設備

ACQUITY超高效液相色譜配備二極管陣列檢測器，美國Waters公司；AL204-IC電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；KQ-600B超聲波清洗器，昆山市超聲儀器公司；隔膜真空泵，天津奧特塞恩斯儀器有限公司；氮吹儀，美國Organomation公司；AccuPrep MPS凝膠凈化儀，美國J2 Scientific 公司；0.22 μm有機相濾膜；試驗用水均為經Milli-Q公司超純水器純化的超純水。

1.3 樣品前處理

將葡萄干、枸杞等樣品凍干后研磨成粉末狀態，并稱取等量的葡萄干、枸杞粉末混勻備用。

準確稱取5.0 g破碎后的均勻試樣，置于50 mL離心管中，加入20 mL提取液(17 mL乙腈、3 mL超純水)。超聲提取20 min后，以8 000 r/min離心5 min。收集上清液，用氮氣吹至近干。再將殘渣溶解于10 mL乙酸乙酯-環己烷(體積比1∶1)中，采用GPC凈化。

GPC凈化條件：聚苯乙烯凝膠(Biobeads S-X3填料，100 g，400 mm×25 mm)；以乙酸乙酯-環己烷(體積比1∶1)為淋洗劑；流速為5.0 mL/min；進樣體積為5.0 mL；收集22～30 min的洗脫液。將洗脫液于40 ℃下用氮氣吹至近干。再將殘渣用1.0 mL乙腈-水(體積比1∶1)溶解，過0.22 μm有機相膜待測。

1.4 色譜條件

色譜柱采用ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱溫為30 ℃；流動相：A為20 mmol/L乙酸銨溶液，B為甲醇；流速為1.0 mL/min；檢測器為二極管陣列檢測器，掃描范圍為210～750 nm；進樣體積為10 μL。UPLC梯度洗脫程序為0～8 min，90% A；8～11 min，70% A；11～20 min，63% A；20～30 min，55% A；30～37 min，30% A；37～40 min，0% A；40～44 min，0% A；44～47 min，90% A；47～49 min，90% A。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理過程優化

干果之中基質復雜，通常包含大量的脂質、凝膠及碳水化合物，這些物質會影響色譜柱的正常分離從而阻礙色譜的正常分離[13]，因此，需對前處理過程進行進一步優化以減輕基質效應。

酸性染料一般含有磺酸基，易溶于水。本實驗選取水以及與水極性相近的甲醇和乙腈3種提取溶劑。研究表明，當使用甲醇為提取劑時，樣品經溶解后為漿糊狀，高速離心后仍分層不明顯，從而無法準確測定；當使用乙腈、水為提取溶劑時，所有染料均可檢出，但酸性橙10、酸性紅73等染料回收率小于32%，未達到檢測要求。考慮到乙腈和水的萃取特性，通過不斷增加乙腈-水溶液中水的比例，來探求一種合理的萃取溶劑。當乙腈和水的體積比為19∶1、18∶2時，酸性橙10的回收率均低于50%；當乙腈和水的體積比為17∶3時，除酸性藍7和酸性黃151的回收率為72%左右，其余染料回收率均高于82%，萃取效果良好。因此，本實驗選取乙腈-水(體積比17∶3)為提取溶劑。

采用GPC凈化方法將干果中的脂質、多糖等干擾雜質去除。實驗發現，在22 min前收集液無染料檢出，在22～30 min中收集液中開始檢出染料，30 min后收集液無染料檢出。因此，收集時間為22～30 min。脂質、糖類等干擾分子在10 min前被檢出，說明該凈化方法有效的避免了基質效應。

2.2 檢測波長確定

研究表明，在確定最佳洗脫條件后，將檢測波長設定為260、312、300、400、427、500、540、634 nm時，酸性橙10、酸性紅14、酸性黑24、酸性紫43、酸性紫7、酸性藍62，均能達成有效分離，但其他14種并未實現有效分離。為進一步提高方法的定性分析能力，本實驗利用DAD對其余14種酸性染料進行光譜信息采集，得到其完整的光譜圖，如圖1所示。在210～750 nm波長范圍內，均有可檢測定性的峰出現。該方法確定了16種酸性染料的最佳吸收波長。實驗證明，該方法有效的提高了20種酸性染料檢測的靈敏度和特異性，減少了共存物質的干擾，使各物質均達到有效分離。利用DAD中特定程序，根據20種酸性染料的出峰順序，以最佳吸收波長進行檢測，所得液相色譜圖如圖2所示。

圖1 14種酸性染料的光譜圖

1-酸性黃23;2-酸性紅18;3-酸性紫7;4-酸性橙10;5-酸性紅35;6-酸性紅14;7-酸性綠5;8-酸性紅73;9-酸性黑1;10-酸性橙7;11-酸性黑24;12-酸性橙56;13-酸性紫43;14-酸性紫17;15-酸性藍62;16-酸性藍7;17-酸性黃151;18-酸性黃79;19-酸性棕282;20-酸性綠73

2.3 方法靈敏度(線性范圍、檢出限、定量限)

配制20種酸性染料系列標準混合液(5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μg/mL)進行測定。以20種染料的質量濃度(μg/mL)為橫坐標，峰面積為縱坐標進行擬合，線性結果如表1所示。結果顯示除酸性黑24和酸性橙56外，其余18種酸性染料在5～50 μg/mL范圍內均具有良好的線性關系，相關系數均大于0.98。酸性黑24和酸性橙56則在10～80 μg/mL和10～60 μg/mL范圍內有良好線性關系，相關系數分別為0.999 9 和0.988 3。儀器的檢測限(limit of detection，LOD)和定量限(limit of quantitation，LOQ)分別為3倍信噪比和10倍信噪比時的濃度(表1)，該方法的LOD和LOQ分別為0.01～0.08 μg/g和0.04～0.25 μg/g。

表1 二十種染料的線性范圍和相關系數

2.4 方法精密度與準確度

對干果(枸杞和葡萄干)樣品采用外標法進行加標回收實驗，加標水平分別為5、10、20 μg/mL，依照優化后的方法平行測定6份。分析結果列于表2，空白加標樣本的液相色譜圖如圖3所示。結果表明，該方法可避免雜質干擾。在添加量為5～20 μg/mL時，干果中20種酸性染料的回收率在71%～114%，相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)小于7.5%。因此，本方法對測定干果中的20種酸性染料具有良好的準確性、精密度。

表2 干果中20種染料的回收率和相對標準偏差

1-酸性黃23;2-酸性紅18;3-酸性紫7;4-酸性橙10;5-酸性紅35;6-酸性紅14;7-酸性綠5;8-酸性紅73;9-酸性黑1;10-酸性橙7;11-酸性黑24;12-酸性橙56;13-酸性紫43;14-酸性紫17;15-酸性藍62;16-酸性藍7;17-酸性黃151;18-酸性黃79;19-酸性棕282;20-酸性綠73

2.5 實際樣品測定

為了確認優化方法的可行性，于新疆烏魯木齊市農產品市場葡萄干、枸杞等各65批次樣品，并使用本文優化的方法對20種酸性染料進行測定。結果表明，其中3個批次的枸杞和葡萄干中均檢測到酸性紅18，最高濃度為1.91 μg/g。其余19種酸性染料均未檢出。實驗證明，在干果中確有酸性染料存在，但均低于《食品添加劑使用標準》中的使用量。

3 結論

本文建立了一種依托于超高效液相色譜法同時測定干果中的20種酸性染料的方法，該方法使用乙腈-水溶劑提取、使用GPC凈化的方法對樣品進行前處理，并分析了20種酸性染料的光譜特性，優化了檢測條件。經檢驗，該方法線性范圍良好，檢測限和定量限較低，具有良好的回收率和準確性。本方法成本低、檢測快，適合批量檢測干果中的酸性染料的含量。