青梅野生酵母菌的篩選鑒定與耐受性研究

杜沁嶺，屠婷瑤，徐文，王松濤，董怡，賈冬英*

1(四川大學 輕工科學與工程學院，四川 成都，610065)2(瀘州品創科技有限公司，四川 瀘州，646000)

青梅果含有多種有機酸、礦物質、維生素、多酚、黃酮等物質，具有濃郁的香氣和突出的特征風味，是釀造養生果酒的良好原料[1]。青梅果酒不僅具有良好的口感與獨特的風味，同時能有效保留青梅中的營養與活性成分[2-3]，成為亞洲地區深受歡迎的發酵酒。

酵母菌是果酒生產最為關鍵的因素，對其品質至關重要。目前，國內青梅果酒釀造主要采用葡萄酒釀造酵母，將其用于青梅發酵時不能較好地適應青梅汁的高酸環境，導致青梅果酒發酵時間長、酒體單薄、風味不足、缺乏典型性[4]。因此，篩選優良青梅果酒釀造專用酵母是提高其品質的關鍵。目前，國內外有關青梅果酒釀造專用酵母的研究較少，且大多以青梅自然發酵液或者青梅果實作為菌種分離源。趙玲燕[5]從青梅發酵液中分離出100株酵母，通過三級篩選獲得1株產酒精和發酵能力較好的青梅釀酒酵母；王輝等[6]從大肉青梅自然發酵液中分離出1株能耐受pH 3.0和葡萄糖質量濃度為400 g/L且可產生良好香氣的酵母菌。然而，目前尚未見這些酵母菌用于青梅果酒生產的報道。糖漬能夠抑制青梅的雜菌生長和部分代謝酶的活性，同時還能保留青梅特有的香氣，降低有機酸含量，是制備青梅露和保留青梅風味的有效方法，也是獲取青梅野生酵母的重要途徑。本研究從糖漬青梅液和青梅果皮中分離出10株野生酵母菌，通過形態學觀察和發酵特性研究篩選出6株酵母菌，采用26S rDNA序列分析對其進行鑒定，并探討了其耐受乙醇、葡萄糖和低pH的能力，以期獲得具有良好發酵性能的青梅果酒專用酵母，為優質青梅果酒的生產提供重要保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糖漬青梅液是成都大邑種植的新鮮青梅洗凈、瀝水后稱重，分別加入其質量30%、40%、50%的白砂糖，密封后分別于室溫下放置至白砂糖完全溶解；YPD固體培養基、YPD液體培養基，青島海博生物技術有限公司；無水葡萄糖、無水乙醇等，國產分析純試劑。

GHP-9080隔水式培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；UV-6000PC紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；ZHWY-1102C恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母菌分離純化

將1 mL糖漬青梅液以10倍梯度稀釋法稀釋至10-3～10-7，取0.1 mL稀釋液于YPD固體培養基上，涂布均勻后28 ℃下培養2 d。觀察菌落形態后挑取表面光滑濕潤、中間隆起的具有典型酵母菌形態特征的單個菌落進行平板劃線，純化培養2次后顯微鏡下觀察其菌體形態、形狀、繁殖方式，然后進行保藏。

1.2.2 酵母菌篩選

(1)產氣性能測定：在含有杜氏小管的YPD液體培養基中加入分離出的酵母菌，分別于28 ℃下培養24、48 h觀察杜氏管中出現氣體的情況[7]。

(2)產乙醇、產香和發酵能力測定：按照2%(體積分數)的接種量(菌液濃度為107CFU/mL)，將分離菌株接種于100 mL YPD液體培養基(葡萄糖質量濃度調整為260 g/L)，28 ℃下振蕩(100 r/min)發酵8 d，測定發酵液的酒精度[7]，評價發酵液的香氣，并參照GB/T 10345—2022《白酒分析方法》測定其總酯含量[8]，相同條件下以未調整葡萄糖的YPD液體培養基進行發酵力測定，發酵過程中每隔12 h測定1次質量，直至第8天。以發酵時間(x，min)為橫坐標，CO2質量損失(y，g)為縱坐標，繪制發酵力曲線[7]。

1.2.3 酵母菌分子生物學鑒定

在北京擎科生物科技有限公司完成。采用通用引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)進行26S rDNA擴增并測序。將測序結果在 NCBI 數據庫中與已知序列進行同源比對分析，并采用MEGA 7.0軟件繪制系統發育樹。

1.2.4 酵母菌耐受性測定

參照李亞輝等[7]的方法對篩選酵母菌的耐受性進行測定，并稍作修改。調整YPD液體培養基中乙醇的體積分數(4%、6%、8%、10%、12%)，葡萄糖的質量濃度(300、350、400、450、500 g/L)和pH(2.5、2.7、2.9、3.1、3.3、3.5)，按照1.2.2(2)方式接種，于28 ℃下振蕩(150 r/min)發酵48 h，在600 nm下測定發酵液的OD值，分別以不添加乙醇、葡萄糖、乳酸的YPD培養基為空白對照。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 酵母菌的篩選

2.1.1 形態觀察

對分離純化后得到的酵母菌進行形態觀察和顯微鏡鏡檢后除去重復菌株，共篩選出10株酵母菌，編號為J1～J10，其菌落形態和細胞形態分別見表1和圖1。10株菌的菌落形態相似，多為疏松狀、圓形、突起、濕潤、光滑的典型酵母菌落形態，但其菌落顏色、邊緣規則程度和挑起性卻不盡相同。細胞形態均為出芽繁殖，形狀分橢圓形和圓形兩種。

表1 分離酵母菌的菌落形態和細胞形態

圖1 分離酵母菌的細胞形態

2.1.2 產氣性能

10株菌的產氣能力見表2?？梢钥闯觯齁1外，發酵48 h后其余9株菌的發酵液均出現產氣，表明這些菌株生長和發酵速率快，因此選擇該9株菌進入后續的篩選實驗。

表2 酵母菌產氣能力

2.1.3 產酒能力

9株菌發酵8 d后所得發酵液的酒精度差異較大(表3)。其中，J7、J8和J9產乙醇能力極強，顯著高于其他6株菌(P<0.05)，其發酵液的酒精度均高于10%vol；J3、J4、J5和J10有一定的產乙醇能力，其發酵液的酒精度均超過4.5%vol；但J2和J6產乙醇能力較差，其發酵液的酒精度均低于4%vol。

表3 九株酵母菌的產酒與產香能力及其發酵液的香氣

2.1.4 產香能力

酵母菌在發酵過程中產生的風味物質大多以酯類形式存在。9株菌均具有一定的產香能力，其發酵液的總酯含量和香氣見表3。其中，J3、J5、J6和J10的產酯能力明顯高于其他5株菌(P<0.05)，以J5的產酯能力最高(2.56 g/L)，其發酵液的總酯含量均超過2 g/L，且香氣濃郁。其余5株菌的產酯能力較低，J7和J9發酵液的總酯含量僅為0.93 g/L和0.87 g/L，且香氣平淡。由于青梅果酒發酵菌的選育需要綜合考慮其產酒和產香能力，因此淘汰產酒和產香能力均差的J2和J4。將篩選后得到的7株菌分為兩大類，即產乙醇能力強菌株(J7、J8、J9)和產酯能力強菌株(J3、J5、J6、J10)，分別測定其發酵力。

2.1.5 發酵力

酵母菌可利用糖進行發酵，并產生大量的CO2和乙醇，故CO2質量損失的多少可用于判斷菌株發酵能力的強弱[9]。產乙醇能力強菌株的發酵力如圖2所示。在發酵前36 h，J7、J8、J9發酵液的CO2產生量均隨發酵時間延長而增加，第36 h時達到最大，CO2質量損失分別為3.52、3.21、3.49 g，說明此時菌株處于對數生長期，開始大量繁殖；36 h后隨著發酵時間的延長，CO2產生量逐漸下降；第132 h時，3株菌發酵力基本相當，CO2幾乎無質量損失，表明132 h后所有菌株已完成發酵。

圖2 產乙醇能力強菌株的發酵力

產酯能力強菌株的發酵力如圖3所示。在發酵前24 h，J3、J5、J6、J10發酵液的CO2產生量均隨發酵時間的延長而增加，第24 h時達到最大，CO2質量損失分別為1.21、0.97、1.18、1.16 g，表明此時菌株進入發酵旺盛期；24 h后隨著發酵時間的延長，CO2產生量逐漸下降，第180 h時，4株菌發酵力基本相當，CO2幾乎無質量損失，說明180 h后所有菌株已完成發酵。該4株菌的起酵時間較上述3株產乙醇菌提前了12 h，且CO2產生量普遍較低，這可能是產酯菌與產乙醇菌隸屬于不同酵母菌種，具有不同的適宜生長條件、代謝特點和發酵能力[10]。產乙醇菌的生長能力更強，對發酵底物利用更充分，能夠釋放出更多的CO2?？衫么颂匦詫⒃?種不同類型酵母菌分別接種進行青梅果酒發酵。綜合以上結果，淘汰發酵力較弱的J5(CO2質量損失<1 g)，選擇其余6株菌進行后續的分子生物學鑒定和耐受性實驗。

圖3 產酯能力強菌株的發酵力

2.2 篩選菌株的鑒定

對6株菌DNA分別進行提取和PCR擴增后得到其電泳圖(圖4)。全部菌株的DNA片段長度在500～750 bp左右，其基因序列長度符合酵母菌理論預期[11]。用MEGA軟件處理同源菌株基因得到6株菌的系統發育樹(圖5)。J7、J8和J9與釀酒酵母的同源性較高，J3、J6和J10與葡萄汁有孢漢遜酵母同源性較高。因此，確定前3株菌為釀酒酵母，后3株菌為葡萄汁有孢漢遜酵母。

圖4 酵母菌 PCR擴增電泳圖

圖5 六株酵母菌的系統發育樹

2.3 酵母菌的耐受性

2.3.1 乙醇耐受性

高濃度乙醇可抑制酵母菌細胞的生長和活力，影響其發酵效果[12]。6株酵母菌的乙醇耐受性見表4。隨著乙醇體積分數增加，6株菌的耐受能力逐漸減弱，且3株釀酒酵母對乙醇的耐受能力明顯強于3株葡萄汁有孢漢遜酵母(P<0.05)，以J7和J8的耐受性最強，它們在10%乙醇中仍可生長旺盛。耐乙醇能力強的菌株可使發酵更完全，從而提高發酵酒的酒精度[13]。雖然3株釀酒酵母在高于10%乙醇中耐受能力減弱，但在YPD培養基發酵中產生酒精度超過10%vol，說明其適應性馴化能力較強，這種類型酵母可通過采用基因轉錄調節方式提高其乙醇耐受性[14]。葡萄汁有孢漢遜酵母的生長受到高體積分數乙醇的顯著抑制，J3、J6和J10分別在8%、6%和8%乙醇條件下生長受到抑制。隨著發酵的進行，培養基中營養物質缺乏和乙醇含量增加對非釀酒酵母生長的抑制作用更加明顯，這與馮文倩等[15]關于葡萄汁有孢漢遜酵母對乙醇的耐受結果相似。本研究中篩選出的6株菌對乙醇的耐受能力高于從青梅自然發酵液中篩選得到的酵母菌[6]。

表4 六株酵母菌的乙醇耐受性

2.3.2 葡萄糖耐受性

葡萄糖是酵母菌發酵的動力能源，但其濃度過高則會抑制酵母菌的生長，優良酵母菌株應具備較高的葡萄糖耐受能力[16]。6株酵母菌的葡萄糖耐受性見表5。6株菌均能耐受400 g/L葡萄糖，且3株釀酒酵母在<400 g/L葡萄糖中的生長能力明顯強于3株葡萄汁有孢漢遜酵母(P<0.05)，以J7的耐受能力最強。這是因為釀酒酵母細胞能充分利用葡萄糖進行生長繁殖，產生更多的乙醇[17]。釀酒酵母J7、J8和J9對葡萄糖的耐受能力隨其質量濃度的增加先增大后減弱，在初始葡萄糖為300 g/L時耐受性最強；產酯酵母J3、J6和J10對葡萄糖的耐受能力隨其質量濃度的增加持續減弱。造成該兩種類型酵母對葡萄糖耐受能力變化趨勢不同的原因在于外部環境的滲透壓對兩種酵母細胞代謝酶活性抑制的臨界條件不同[18]。然而，當初始葡萄糖為450 g/L時，3株釀酒酵母均表現出明顯的生長抑制，其生長能力顯著低于葡萄汁有孢漢遜酵母(P<0.05)。這可能是因為釀酒酵母在高糖條件下發酵更加徹底，將糖分轉化為更多的酒精，從而抑制其生長。當初始葡萄糖為500 g/L時，6株菌均不具備生長能力。

表5 六株酵母菌的葡萄糖耐受性

2.3.3 低pH耐受性

酸脅迫是果酒發酵過程中最常見的不利條件之一。一般情況下，釀酒酵母最適生長pH為3.8～6.0，極少數用于果酒發酵的酵母菌可能具有耐受pH 3.2的環境條件[19-20]。因此，篩選可耐受低pH環境的酵母菌是青梅果酒釀造的關鍵[2]。6株菌的低pH耐受性見表6。在pH為3.3～3.5時，6株菌均能正常生長(OD600<2.0)，但其耐受能力有所差異。其中，J3、J7、J9和J10耐受能力明顯高于J6和J8(P<0.05)，以J7耐受能力最強；當pH<3.3時，6株菌的耐受能力均隨著pH降低逐漸減弱；當pH為2.9時，J3、J6、J7、J8和J9仍可正常生長，以J9和J6的生長最為旺盛，但J10表現出明顯的生長抑制(P<0.05，0.5

表6 六株酵母菌的低pH耐受性

3 結論

本研究從糖漬青梅液和新鮮青梅果皮中分離出青梅野生酵母菌，并探討了其發酵特性。通過菌落形態和細胞形態觀察篩選出10株不同形態的酵母菌，編號為J1～J10；通過比較菌株的產氣、產酒和產香能力及發酵力獲得6株具備優良性能的酵母菌，分別為J3、J6、J7、J8、J9、J10；26S rDNA測序鑒定為釀酒酵母(J7、J8、J9)和葡萄汁有孢漢遜酵母(J3、J6、J10)。6株酵母菌具備較好的耐受能力，能耐受4%(體積分數)、400 g/L葡萄糖和pH 3.1的環境條件，且釀酒酵母對乙醇的耐受能力強于葡萄汁有孢漢遜菌，但其對葡萄糖耐受能力低于后者。整體而言，本研究篩選獲得的6株酵母菌具備良好的發酵性能和較好的生長特性與耐受能力，經過馴化后有望成為優質青梅果酒釀造菌種。