基于Lachancea thermotolerans-Saccharomyces cerevisiae雙酵母混合發酵酸啤酒的工藝研究

付曉芬，郭立蕓，侍亞敏，謝鑫，宋玉梅，李十中

1(北京燕京啤酒股份有限公司技術中心，啤酒釀造技術北京市重點實驗室，北京，101300)2(清華大學核能與新能源技術研究院，北京，100084)

伴隨著生活方式的轉變與消費需求的多元化，新一代啤酒消費者對于個性化釀造和新風格啤酒的需求日益增長，促使啤酒企業不斷向產品多元化和高端化方向布局。非釀酒酵母是商業啤酒釀造中的非常規酵母，雖然其發酵性能不如釀酒酵母，但其對啤酒總體香氣特征的復雜性和多樣性有著積極的影響。近年來，對非傳統酵母的開發和應用成為中外葡萄酒和精釀啤酒的熱點，針對非釀酒酵母在發酵技術和方法上也不斷產生新的觀點[1-2]。將具有不同特性的非釀酒酵母與常規釀造釀酒酵母進行組合發酵，改良原有產品的風格缺陷，增強產品的風味，這種基于不同酵母的混菌發酵模式在葡萄酒的規模釀造中已得到較好的應用[3-5]，但鮮有將這種混菌發酵技術應用于大規模啤酒生產中的嘗試。雖然這種基于不同酵母混菌發酵開發特色啤酒的方法極具前景，但因其需對工藝條件進行重大調整，以及發酵過程的穩定性等問題的存在，很多大規模釀造工廠不愿在工業條件下使用混合發酵方式生產啤酒。

近年來，人們對風味高度復雜的酸啤酒的興趣大大增加[6]。與常規的艾爾啤酒和拉格啤酒相比，酸啤酒含有大量的有機酸(如乳酸和乙酸)，使得其pH值偏低。傳統酸啤酒的生產起源于比利時傳統酸啤酒Lambic釀造工藝[7-8]，該工藝利用復雜的微生物菌群自發發酵進行生產，通過長期的發酵過程(1～3年)可形成富含多種代謝物的傳統酸啤酒。然而，傳統酸啤酒的釀造工藝存在發酵周期長、釀造過程不可控、產品質量穩定性差等諸多問題降低了其大規模生產的可能性。為了規避野生菌群引發的產品質量不穩定和發酵失敗風險大等問題，在煮沸麥芽汁前接入乳酸菌發酵劑進行糖化鍋酸化法(kettle souring)[6,9]，48 h后依次進行煮沸、釀酒酵母發酵與木桶老化。采用此方法生產酸啤酒雖然發酵耗時相對較短，但提前酸化工藝仍然增加了工藝操作步驟，且對后期的罐體消殺要求較高。同時，煮沸后乳酸菌產生的揮發性物質減少，也是其缺點之一。雖然可使用木桶陳釀來增加啤酒香氣的復雜性，但這又延長了酸啤酒的生產周期。另有研究[10-11]將乳酸菌與釀酒酵母混合發酵或發酵后期添加乳酸菌進行酸啤酒生產，但由于大部分乳酸菌屬于細菌，受到啤酒花的抑制作用，很難在釀酒酵母存在的情況下形成生長優勢，所以其產生的乳酸和其他風味物質也很有限。國內外對酸啤酒的研究和開發已是熱點，但鮮有研究利用不同酵母進行可調控的混合發酵酸啤酒。

為了獲得一款適用于大規模生產且果味馥郁的酸啤酒產品，本研究選擇在基質利用和風味產生方面具有一定潛力的不同酵母菌種組合構建穩定的雙酵母混菌發酵體系，基于工業條件下成熟穩定的啤酒釀造工藝，利用工業標準麥芽汁(不添加外源風味物質)生產新型果味酸啤酒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

釀酒酵母Saccharomycescerevisiae68obg、耐熱拉錢斯氏酵母LachanceathermotoleransFBA-2、布魯塞爾酒香酵母BrettanomycesbruxellensisWDB24菌株由實驗室菌種保藏中心提供；馬克斯克魯維酵母Kluyveromycesmarxianus1695、Kluyveromycesmarxianus1042和耐熱拉錢斯氏酵母Lachanceathermotolerans1548菌株由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供。

1.1.2 培養基與溶液

擴培培養基：麥芽汁由某公司糖化車間生產，115 ℃滅菌20 min。

發酵培養基：添加終體積分數為2%果葡糖漿至麥芽汁，以增加非釀酒酵母可利用糖含量，115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 實驗試劑

次甲基藍(分析純)，天津百世化工有限公司；硫酸鈣(分析純)，天津市風船化學試劑科技有限公司；水合茚三酮、乙醛等標準品(色譜純)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖(色譜純)，大連美侖生物技術有限公司，疊氮溴化乙錠(分析純)，美國Sigma公司。

1.1.4 儀器與設備

Agilent 1260高效液相色譜儀、G1888-6890氣相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；UV1280紫外可見分光光度計，日本島津公司；ABI7500定量PCR儀，美國Applied Biosystems公司；DX-320離子色譜儀，美國戴安公司；Anton Paar(Ⅳ型)啤酒分析儀，安東帕公司；生化培養箱，上海智城分析儀器制造有限公司；IY1200酵母計數儀，上海睿鈺生物科技有限公司；FE28 pH計，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；MIR-253型生化培養箱，日本三洋公司；超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；高壓滅菌器，日本HIRAYAM公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 啤酒發酵實驗

活化后菌液接種至含250 mL麥芽汁的500 mL三角瓶中，25 ℃靜置培養24 h，制備種子液，按1×107～1.2×107CFU/mL的接種量接種至麥芽汁發酵培養基中，20 ℃靜置培養7 d，然后將600 mL發酵液注入無菌卡箍瓶中，壓蓋后在0 ℃下貯酒7 d。(每個樣品3個平行)。

1.2.2 雙酵母混合發酵體系不同種酵母數量變化分析

將qPCR與疊氮溴化乙錠(ethidium monoazide bromide, EMA)活菌處理技術相結合，實現對混合發酵體系中各菌株定量分析，從而可以快速表征雙酵母混合發酵體系各酵母的動態變化趨勢。

與亞甲基藍染色法顯微監測法分析細胞死亡率[12]進行關聯分析，酵母死亡率測定采用亞甲基藍染色法。確定適用于2株酵母菌種的EMA預處理條件為EMA濃度在20 μmol/L、避光放置10 min后，將樣品放置在距500 W鹵素燈10 cm處曝光15 min，可有效抑制死菌DNA的擴增,從而排除死菌DNA擴增對qPCR菌株定量的影響。將已知濃度的酵母純培養菌液，進行10倍梯度稀釋，之后分別進行EMA-qPCR檢測，其中兩酵母特異性引物分別為S.cerevisiaeCESP-F：ATCGAATTTTTGAACGCACATTG，SCER-R：CGCAGAGAAACCTCTCTTTGGA[13]；L.thermotoleransLTH2-F CGCTCCTTGTGGGTGGGGAT，LTH2-R CTGGGCTATAACGCTTCTCC[14]。30 μL的qPCR反應體系為12 μL的Sybrgreen Mix(天根)，1 μL上游引物和下游引物，1 μL的模板DNA，15 μL的滅菌水。qPCR反應程序為95 ℃ 5 min，40個循環，每個循環95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，在每個循環的延伸階段進行熒光信號檢測，最終得到104、105、106、107、108、109CFU/mL活細胞的標準曲線, 確定qPCR相應循環閾值(cycle threshold, Ct)和平板計數之間的相關性，實現各菌株的定量分析，最后應用EMA-qPCR監測技術動態表征雙酵母混合發酵體系中各單菌生長狀態。

1.2.3 雙酵母混合發酵體系穩定性實驗

將混菌發酵體系逐級進行發酵體積放大，分別進行500 mL三角瓶、2 L發酵瓶、100 L發酵罐雙酵母混合發酵酸啤酒實驗，監測發酵過程各關鍵參數和風味的穩定性。

1.2.4 有機酸含量的測定

有機酸對啤酒的風味和口感有很大影響，是評價酸啤酒的重要指標。采用離子色譜方法測定酒液中的有機酸(乳酸、乙酸、甲酸、丙酸、丙酮酸、琥珀酸、酒石酸、草酸、富馬酸和檸檬酸)成分。將混合標準溶液與樣品待測液分別注入離子色譜儀，測得各有機酸的響應值(峰面積)，經與標準溶液色譜圖比較響應值(峰面積)得到待測樣品有機酸濃度。

1.2.5 酒精度、發酵度的測定

根據GB 5009.225—2016《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定》對真正發酵度及酒精度進行測定[15]。

1.2.6 可發酵糖含量的測定

使用高效液相色譜儀對發酵液中的主要糖類進行測定[16]。

1.2.7 風味物質含量的測定

使用氣相色譜儀對蒸餾后的發酵液中風味物質進行測定[12]。氣相色譜條件：色譜柱Agilent CP-WAX(50 m×250 μm×0.25 μm)，載氣為高純氮氣(>99.999%)；柱流速為1 mL/min；進樣口溫度250 ℃；檢測器溫度148.8 ℃；程序升溫：起始溫度35 ℃，保持1 min，以3 ℃/min升至70 ℃，保持15 min，再以3.5 ℃/min升至190 ℃，保持22 min；進樣體積為1 μL；分流進樣，分流比30∶1。

1.2.8 啤酒感官品評

目前啤酒行業廣泛采用的描述類感官評價方法是定量描述分析法(quantitative descriptive analysis, QDA)，由10名啤酒感官評定專業人員組成評定小組，對啤酒的口感、口味和香氣進行感官評定，并按照風味強度評分。

2 結果與分析

2.1 產酸酵母的篩選實驗

參考相關研究[17-19]，對具有一定產酸能力和麥芽汁發酵特性的非釀酒酵母進行分析，結果表明，與啤酒酵母68obg相比，大部分非釀酒酵母都只能利用麥芽汁中的葡萄糖、果糖和蔗糖，對麥芽糖、麥芽三糖等麥芽低聚糖基本不代謝，只有L.thermotoleransFBA-2利用少量的麥芽糖，且代謝速率明顯低于釀酒酵母。

對5株非釀酒酵母的有機酸種類和產量進行分析，如表1所示，菌株L.thermotoleransFBA-2的乳酸產量最大，為2.573 g/L。但由于其乳酸和有機酸總量均高于其他菌株，感官品評的結果顯示，酸感明顯，綜合感官品評和風味物質檢測，選擇協調性和爽口性更佳的L.thermotoleransFBA-2釀造酸啤酒。

表1 五株非釀酒酵母利用麥芽汁發酵有機酸產量情況 單位：mg/L

2.2 酵母單一菌株發酵實驗

對S.cerevisiae68obg和L.thermotoleransFBA-2進行單一菌株的麥芽汁發酵實驗，S.cerevisiae68obg發酵效率高，且產酯豐富，酒體丁香風味明顯[20]。如圖1所示，L.thermotoleransFBA-2對麥芽糖的利用能力低，不利用麥芽三糖等麥芽低聚糖，殘糖含量較高。如表1所示，單一菌株L.thermotoleransFBA-2的發酵產物中乳酸和總酸的產量最高，但受限于碳源的利用能力，其他風味物質的產量較低，主要的雜醇異丁醇和異戊醇則明顯低于S.cerevisiae68obg，導致總醇較低，但酯含量比S.cerevisiae68obg高。

圖1 單一菌株利用麥芽汁中可發酵糖情況

發酵過程的失重情況如圖2所示，與S.cerevisiae68obg相比，非釀酒酵母L.thermotoleransFBA-2發酵速率較慢，S.cerevisiae68obg與L.thermotoleransFBA-2發酵液的酒精度分別為6.75%vol和2.11%vol。感官品評的結果也表明，菌株L.thermotoleransFBA-2的發酵酒液酸感突出，影響了酒體的協調性和適飲性，其他風味表現不突出，與S.cerevisiae68obg發酵所得的標準啤酒相比，風格差異較大。在葡萄酒的研究[21]中發現，將耐熱拉錢斯氏酵母與釀酒酵母混合發酵可增加總酸度、甘油、多糖、2-苯基乙醇等的產量，同時降低葡萄酒的揮發性酸度?？梢?，選擇S.cerevisiae68obg作為雙酵母混合發酵體系的基礎酵母，菌株L.thermotoleransFBA-2作為構建雙酵母混合發酵酸啤酒的風格酵母，可混合釀造酸味協調的酸啤酒。

圖2 單一菌株麥芽汁發酵過程失重情況

2.3 啤酒混菌發酵體系中非釀酒酵母與釀酒酵母最適配比的確定

混合發酵過程存在不同酵母之間的相互作用。大量研究表明[22-23]，非釀酒酵母與釀酒酵母混合發酵與單菌株發酵之間代謝活動存在差異，混合發酵體系中不同酵母菌株的比例對啤酒最終口味起決定性作用。因此，我們將風格酵母L.thermotoleransFBA-2和基礎酵母S.cerevisiae68obg按照100∶1、50∶1、10∶1、1∶1、1∶10、1∶50和1∶100的比例共同接種于發酵麥芽汁中，并添加2%的果葡糖漿，以促進混菌發酵體系中非釀酒酵母充分的生長。

如圖3所示，當混合發酵體系中風格酵母L.thermotoleransFBA-2和基礎酵母S.cerevisiae68obg接種比例為1∶100、1∶50、1∶10時，菌株S.cerevisiae68obg有明顯的生長優勢，細胞增長速率高于風格酵母L.thermotoleransFBA-2，快速成為主導菌株。即使在添加果葡糖漿后的麥芽汁中，與基礎酵母S.cerevisiae68obg競爭利用葡萄糖、果糖、蔗糖，風格酵母L.thermotoleransFBA-2無法形成生長優勢，從而無法對最終的啤酒產品組分產生大的影響。

圖3 不同配比混菌發酵24 h后各酵母細胞狀態

當混合發酵體系中風格酵母L.thermotoleransFBA-2和基礎酵母S.cerevisiae68obg接種比例為100∶1、50∶1時，風格菌株L.thermotoleransFBA-2占據了絕對的生長優勢，即使在發酵后期，菌株S.cerevisiae68obg也沒有在酵母數量上的形成優勢，而當混合發酵體系中風格酵母L.thermotoleransFBA-2和基礎酵母S.cerevisiae68obg接種比例為10∶1時，酵母L.thermotoleransFBA-2啟動發酵，發酵中期，逐步衰亡。然后，S.cerevisiae68obg開始占據主導地位，使發酵繼續，直至完成。

2.4 耐熱拉錢斯氏酵母與釀酒酵母混合發酵麥芽汁生產新型果味酸啤酒

綜合啤酒混合發酵體系中風味物質分析和感官品評結果，選擇L.thermotoleransFBA-2和S.cerevisiae68obg混合接種比例為10∶1，麥芽汁中總酵母數控制在1.0×107～1.2×107CFU/mL，利用EMA-qPCR監測技術動態表征雙酵母混合發酵體系中各單菌生長狀態。

2.4.1 EMA-qPCR定量分析建立各酵母標準曲線

使用EMA-qPCR分別建立了L.thermotoleransFBA-2和S.cerevisiae68obg的活細胞含量與Ct值之間的標準曲線，Ct值與活菌濃度呈線性關系，L.thermotoleransFBA-2的標準曲線方程為y=-3.118 2x+38.952，相關系數為R2=0.988 3，如圖4所示，S.cerevisiae68obg的標準曲線方程為y=-3.221 5x+37.235，相關系數為R2=0.993 8，線性關系均良好。EMA-qPCR檢測方法與傳統的平板計數法相比較，能將檢測時間從36 h縮減至3～4 h，可大大提高檢測效率。

2.4.2 混合發酵麥芽汁生產新型果味酸啤酒過程分析

利用EMA-qPCR技術動態表征雙酵母混合發酵體系中各單菌生長狀態，如圖4所示，由于接種比例大，L.thermotoleransFBA-2在進罐第1天后，酵母數量顯著增加，成為優勢菌株，對發酵過程的監測發現，1 d后發酵液的pH值從5.42降至3.51，發酵2 d后pH值為3.33，并一直保持到第7天。2 d后，隨著可利用糖的耗盡，L.thermotoleransFBA-2活性下降，而后S.cerevisiae68obg利用發酵液中殘留的麥芽糖和麥芽三糖等可發酵糖，其酵母數不斷增加，由于L.thermotoleransFBA-2在發酵前期處于優勢地位，對S.cerevisiae68obg有明顯的抑制作用，相比于S.cerevisiae68obg的單菌發酵，其酵母數量增長受限，最高僅為1.38×107CFU/mL，因此，發酵結束后酒液中由S.cerevisiae68obg產生的醇類物質相對含量下降，發酵液的酒精度在5.55%vol。

圖4 EMA-qPCR動態表征雙酵母混合發酵體系中各酵母數變化情況

從實驗室條件逐級放大有效發酵體積到100 L發酵罐麥芽汁發酵實驗，如表2、表3所示，通過對發酵過程中相關關鍵參數的監測，乳酸含量為1.5～1.8 g/L，酒液pH值為3.3～3.4，酒精度約在5%vol，可見由非釀酒酵母與釀酒酵母構建的啤酒雙酵母混合發酵體系具有一定的穩定性。

表2 雙酵母混合發酵酸啤酒發酵性能參數

在雙酵母混合發酵體系中非釀酒酵母和釀酒酵母之間的相互作用[24]會引發酶類和揮發性物質的產量提升，非釀酒酵母L.thermotoleransFBA-2除了產生一定量的乳酸降低酒液pH值，也能給啤酒帶來更多的復雜香氣，如表3所示，相比于單一菌株發酵，雙酵母混合發酵酸啤酒體系其風味物質產量都有所提高，產生了更多乙酸異丁酯和乙酸異戊酯等酯類物質，增強了酸啤酒的水果香氣，感官品評結果也表明，利用雙酵母混合發酵體系釀造的酸啤酒融合了2種酵母的特性，酒體果香馥郁，對啤酒的質量產生積極影響(圖5)。

表3 雙酵母混合發酸啤酒常規風味物質及有機酸產量

圖5 單一菌株及雙酵母混菌發酵啤酒感官品評結果

3 結論

將非釀酒酵母L.thermotoleransFBA-2作為混菌發酵的風格菌株，基于其對常規啤酒發酵用麥芽汁的利用情況，優化原料配方，并選擇一株常規發酵釀酒酵母S.cerevisiae68obg作為基礎發酵菌株，以便保證啤酒的基調，構建了啤酒雙酵母混合發酵體系，并確定了最優接種比例L.thermotoleransFBA-2∶S.cerevisiae68obg為10∶1，用混菌發酵生產的酸啤酒中含有1.5～1.8 g/L乳酸，pH值為3.3～3.4，酒精度約為5%vol，風味豐富度高、爽口協調、果香馥郁，不過分強調酸味。實驗室條件和100 L發酵罐放大實驗結果表明，利用雙酵母發酵體系發酵酸啤酒不僅能夠融合2種酵母的特性，還可以對啤酒的質量產生積極影響，酒體果香馥郁，并且這一工藝消除了現有酸啤酒的工藝弊端，簡化了釀造操作環節，縮短了發酵時間，可實現更快速的發酵和高水平的過程控制，能夠促進酸啤酒的大規模生產應用。