板栗果實(shí)酚類物質(zhì)及其抗氧化活性研究

李小艷，段鵬慧，張興亮，蘭彥平

1(山西林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西 太原，030009)2(北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹研究所，北京，100093)

板栗(Castaneamollissima)殼斗科栗屬堅果類植物，是我國古老的栽培果品樹種，且有“干果之王”的美稱[1]。板栗品種豐富，在我國分布非常廣泛，是我國重要的生態(tài)型經(jīng)濟(jì)果樹，其果實(shí)營養(yǎng)價值高[2]。近幾年關(guān)于干果果仁及果皮品質(zhì)研究增加，提升干果附加值的研究逐漸被人們重視，牟東嶺等[3]以地方12個核桃品種為材料，通過對品質(zhì)的分析，篩選出不同品質(zhì)特點(diǎn)的核桃品種，為地方核桃產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效提供理論依據(jù)。王琴等[4]對新疆5個巴旦木主品種進(jìn)行果實(shí)香氣品質(zhì)分析，了解不同品種品質(zhì)特點(diǎn)，為堅果不同加工利用提供參考依據(jù)。李杰等[5]對燕山地區(qū)3個板栗品種為試材，在“大板紅”品種中檢測到其他2個未有的特征香氣，可作為香型鮮食果進(jìn)行加工利用。魏歡等[6]對核桃綠殼中大量酚類化合物進(jìn)行測定，在核桃綠殼發(fā)現(xiàn)了未被報到過的6-咖啡酸-d-葡萄糖和6-O-高酰甘酸葡萄糖苷物質(zhì)，為進(jìn)一步研究核桃綠殼，研發(fā)綠殼藥理作用提供參考。AHAD等[7]為實(shí)現(xiàn)核桃綠殼資源的分級利用，利用水、石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯提取了不同極性的酚類化合物，并分別收集了乙酸乙酯層和水層，不同的酚類化合物根據(jù)其組成特性不同來應(yīng)用于食品或添加劑的各種領(lǐng)域。

酚類化合物是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的重要次生代謝產(chǎn)物,具有抗氧化、抑菌消炎、護(hù)肝益腎等保健功能，板栗果實(shí)中多酚是一種具有較好抗氧化活性的天然抗氧化劑[8]，且板栗殼是傳統(tǒng)的中藥成分，研究表明板栗殼中酚類化合物能夠抑制肝細(xì)胞增殖和炎癥[9]。AFRICA等[10]研究發(fā)現(xiàn)通過加熱和壓力處理相結(jié)合可以保持甚至提高開心果、腰果和板栗酚含量和抗氧化活性。邢穎等[11]通過研究水煮、烤制、炒制3種加工方式后板栗殼多酚、黃酮物質(zhì)以及自由基清除率等，為板栗殼的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。目前關(guān)于板栗殼多酚物質(zhì)的研究較多，但未見對殼外和殼內(nèi)抗氧化物質(zhì)分析的研究，通過對15個板栗品種果實(shí)殼外皮、殼內(nèi)膜、果仁的總酚、總類黃酮、黃烷醇物質(zhì)進(jìn)行測定，分析不同品種果實(shí)不同部位抗氧化活性，而多酚的生理活性與其具有的清除自由基的抗氧化性能密切相關(guān)，通過測定DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、還原力，反映板栗不同品種不同部位抗氧化能力。通過主成分分析，挖掘板栗果實(shí)不同部位獨(dú)特的活性功能，為板栗果實(shí)深加工利用提供科學(xué)依據(jù)，提高板栗附加值，也為板栗種質(zhì)資源的研究、新品種的選育提供材料依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗材料采自河北農(nóng)林科學(xué)院昌黎果樹研究所板栗資源圃，果實(shí)成熟于冠層外圍陰面和陽面進(jìn)行隨機(jī)采樣，每個品種采5份，利用冰盒帶回實(shí)驗室進(jìn)行指標(biāo)測定。

碳酸鈉、亞硝酸鈉、氯化鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、香草醛、濃鹽酸、DPPH、過氧化氫等(均為分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；福林酚(分析純)、沒食子酸(色譜純)、兒茶素(色譜純)等，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-3000DE型數(shù)控超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HermleZ326K臺式高速離心機(jī)，上海圣科儀器設(shè)備有限公司；UV1902雙光束紫外分光光度計，上海勤酬衡器有限公司；HH-6數(shù)顯雙列六孔水浴鍋，上海康路儀器設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗方法

參照張京芳等[12]酚類抗氧化成分的提取分離工藝，稱取0.55 g板栗殼外皮、0.11 g板栗殼內(nèi)膜、0.55 g板栗果仁，充分研磨后加部分43%(體積分?jǐn)?shù))酒精于100 mL棕色容量瓶中，料液比為1∶18.5(g∶mL)，在超聲功率305 W提取時間17.5 min，然后過濾，濾液于10 000 r/min離心10 min，濾渣重復(fù)提取、離心，重復(fù)提取3次，每次料液比均為1∶18.5(g∶mL)，合并上清液于100 mL棕色容量瓶，用43%酒精定容后作為提取液，每個品種重復(fù)5次。

1.3.1 酚類物質(zhì)測定

采用Folin-Ciocalteu法測定總酚含量，以沒食子酸等價表示(mg/g)；采用氯化鋁比色法測定總類黃酮含量，以蘆丁等價表示(mg/g)；采用香草醛-鹽酸法測定黃烷醇含量，以兒茶素等價表示(mg/g)。

1.3.2 抗氧化性能的測定

將提取液加入含有DPPH的甲醇溶液中，得到3 mL的反應(yīng)體系后振蕩混勻，在25 ℃下避光放置30 min后于517 nm下測定其吸光度。

將提取液與FeSO4溶液和水楊酸溶液混合后再加入H2O2溶液，得到6 mL的反應(yīng)體系后振蕩混勻，在37 ℃下水浴1 h，于510 nm下測定其吸光度。

將1 mL提取液稀釋4倍與2.5 mL pH 6.6的磷酸緩沖液和2.5 mL 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鐵氰化鉀溶液混合均勻，將該體系置于50 ℃恒溫水浴 30 min，取出加入2.5 mL 10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三氯乙酸溶液,混勻后置于離心機(jī)內(nèi)3 000 r/min離心10 min，取2.5 mL上清液與2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鐵溶液混合，700 nm下測定其吸光度。

1.4 統(tǒng)計分析

利用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過Origin 2019b進(jìn)行顯著性與主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種板栗果實(shí)不同部位酚類物質(zhì)比較

2.1.1 不同品種板栗果實(shí)不同部位總酚物質(zhì)含量比較

總酚物質(zhì)在植物抗逆反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，是重要的保健物質(zhì)。圖1展示了15個板栗資源果實(shí)不同部位總酚物質(zhì)含量，由圖1可知，不同資源果實(shí)總酚物質(zhì)含量差異顯著，且果實(shí)不同部位酚類物質(zhì)含量差異明顯。圖1-a中板栗石豐和雜-35果實(shí)殼外皮酚類物質(zhì)含量顯著最高，其中石豐分別比廣西玉林、廣西油栗、燕紅高550%、466%、457%(P<0.05)。板栗殼內(nèi)膜總酚物質(zhì)含量較高，由圖1-b可知,15個板栗資源殼內(nèi)膜總酚含量均在23 mg/g以上，其中黑燕青殼內(nèi)膜總酚含量顯著最高，為61.09 mg/g(P<0.05)。板栗果仁中總酚含量如圖1-c所示，雜-35、燕平、桐優(yōu)-33果仁中總酚含量較高，均高于1.62 mg/g，其中雜-35果仁中總酚含量是燕豐的18.46倍。

a-殼外皮;b-殼內(nèi)膜;c-果仁

2.1.2 不同品種板栗果實(shí)不同部位總類黃酮物質(zhì)含量比較

酚類物質(zhì)分為黃酮類和非黃酮類物質(zhì)，其中黃酮類物質(zhì)是一種重要的次生代謝物，在板栗殼內(nèi)膜含量較高。圖2展示了15個板栗品種果實(shí)不同部位總類黃酮物質(zhì)含量差異，由圖2-a可知，石豐和雜-35殼外皮總類黃酮含量顯著最高，分別為1.08、1.04 mg/g，廣西玉林和廣西油栗殼外皮總類黃酮含量顯著最低(P<0.05)；由圖2-b可知，廣西玉林和雜-35殼內(nèi)膜總類黃酮含量顯著最高(P<0.05)，但15個板栗品種殼內(nèi)膜總類黃酮含量均在8.89 mg/g以上。果仁中總類黃酮含量如圖2-c所示，金豐板栗果仁中總類黃酮含量顯著最高(P<0.05)，桐優(yōu)-33和雜-35果仁中總類黃酮含量顯著高于魯栗3號等9個品種(P<0.05)。

a-殼外皮;b-殼內(nèi)膜;c-果仁

2.1.3 不同品種板栗果實(shí)不同部位黃烷醇物質(zhì)含量比較

板栗果實(shí)不同部位黃烷醇含量如圖3所示，由圖3-a可知，桐優(yōu)-33和金豐板栗果殼外皮黃烷醇含量顯著最高，且分別比燕平高30.56%、29.62(P<0.05)；魯栗3號等8個品種果殼外皮黃烷醇含量低于1.00 mg/g。果殼內(nèi)膜黃烷醇含量如圖3-b所示，其中魯栗3號、黑燕青、燕紅果殼內(nèi)膜黃烷醇顯著最高(P<0.05)，均高于84.14 mg/g，桐優(yōu)-33果殼內(nèi)膜黃烷醇含量顯著最低，但桐優(yōu)-33果殼外皮和果仁黃烷醇含量均顯著最高(P<0.05)，這說明果殼內(nèi)膜中黃烷醇含量不影響果殼外皮和果仁中黃烷醇含量。

a-殼外皮;b-殼內(nèi)膜;c-果仁

2.2 不同品種板栗果實(shí)不同部位抗氧化活性比較

2.2.1 不同品種板栗果實(shí)不同部位DPPH自由基清除率比較

DPPH自由基和羥自由基清除率能夠反映果實(shí)的抗氧化性能，15個板栗品種果實(shí)不同部位DPPH自由基清除率如圖4所示，不同品種板栗殼外皮和果仁部位DPPH自由基清除率差異顯著，由圖4-a可知，金豐板栗殼外皮DPPH自由基清除率顯著最高，分別比廣西玉林和廣西油栗高57.91%、63.70%(P<0.05)。板栗殼內(nèi)膜DPPH自由基清除率較高，除金豐和燕平品種外，其他13個品種殼內(nèi)膜DPPH自由基清除率均在87.00%以上，且差異不顯著。而由圖4-c可知，燕平果仁DPPH自由基清除率顯著最高，這與燕平殼內(nèi)膜DPPH自由基清除率顯著最低相反。桐優(yōu)-33和雜-35果仁DPPH自由基清除率顯著低于燕平，但顯著高于其他12個板栗品種(P<0.05)。

a-殼外皮;b-殼內(nèi)膜;c-果仁

2.2.2 不同品種板栗果實(shí)不同部位羥自由基清除率比較

羥自由基是一種活性氧，具有極強(qiáng)的氧化能力，板栗果實(shí)中清除羥自由基能力越強(qiáng)，說明板栗果實(shí)該部位抗氧化能力越強(qiáng)。圖5展示了15個板栗品種果實(shí)不同部位羥自由基清除率，由圖5-a可知，除品種石豐外，板栗殼外皮羥自由基清除率均較高，其中雜-35、廣西玉林、黑煙青3個品種殼外皮羥自由基清除率顯著最高(P<0.05)。由圖5-b可知，15個板栗品種殼內(nèi)膜羥自由基清除率差異明顯，其中雜-35殼外皮和內(nèi)膜羥自由基清除率均顯著最高(P<0.05)。15個板栗品種果仁羥自由基清除率均在66.67%及以上，其中岱岳早豐、金平、廣西油栗果仁羥自由基清除率顯著最高，分別為93.59%、91.03%、93.59%，表現(xiàn)極強(qiáng)的抗氧化性。

a-殼外皮;b-殼內(nèi)膜;c-果仁

2.2.3 不同品種板栗果實(shí)不同部位還原力比較

不同品種板栗果實(shí)不同部位還原力如圖6所示，由圖6-a可知，廣西油栗的殼外皮還原力顯著最高，為97.46%，其次桐優(yōu)-33、廣西玉林、燕平殼外皮還原力顯著高于其他11個品種。由圖6-b可知，廣西油栗等8個品種殼內(nèi)膜還原力均在80.00%以上，且8個品種間差異不顯著(P>0.05)，岱岳早豐殼內(nèi)膜還原力顯著最低，為61.49%(P<0.05)。由圖6-c可知，果仁還原力較高，其中煙泉和廣西油栗果仁還原力均為98.51%，顯著高于其他13個品種(P<0.05)。

a-殼外皮;b-殼內(nèi)膜;c-果仁

2.3 不同品種板栗果實(shí)不同部位酚類及抗氧化活性主成分分析

通過3種酚類物質(zhì)及3種抗氧化物活性對15個板栗品種不同部位主成分分析得分圖如圖7所示，通過2個主成分可以有效地將板栗不同部位抗氧化能力區(qū)分開。由圖7-a可知，板栗殼外皮酚類及抗氧化活性前2個主成分累計方差貢獻(xiàn)率為76.23%，桐優(yōu)-33、金豐、石豐品種在第一和第二主成分均為正值，其中石豐主成分得分最高，為殼外皮抗氧化能力較強(qiáng)的品種；由圖7-b可知，殼內(nèi)膜酚類及抗氧化活性前2個主成分累計方差貢獻(xiàn)率為62.29%，在第一和第二主成分排名前三的品種為黑煙青>廣西油栗>燕紅，為殼內(nèi)膜抗氧化能力較強(qiáng)的品種；在圖7-c中，果仁前2個主成分累計方差貢獻(xiàn)率為68.54%，其中桐優(yōu)-33、燕平、雜-35板栗果仁主成分得分較高，果仁抗氧化能力表現(xiàn)較強(qiáng)。

3 討論與結(jié)論

板栗果實(shí)中多酚是一種天然抗氧化劑，且板栗果殼具有藥用保健功效，我國關(guān)于板栗的研發(fā)多集中在果仁，且板栗的育種以抗性、成熟期、產(chǎn)量、果實(shí)中淀粉、蛋白質(zhì)等為重要指標(biāo)[13-14]，關(guān)于板栗果實(shí)中酚類抗氧化物質(zhì)作為指標(biāo)進(jìn)行選擇性育種的工作開展得不多，缺乏相關(guān)理論指導(dǎo)。本研究通過采用超聲波提取技術(shù)，對板栗果實(shí)不同部位酚類物質(zhì)及抗氧化劑活性進(jìn)行測定，表明板栗不同品種、不同部位酚類及抗氧化性能差異明顯，且殼內(nèi)膜總酚含量是殼外皮和果仁總酚含量的10倍左右，這可能與酚類相關(guān)的代謝基因在果實(shí)不同部位表達(dá)量不同造成[15-16]。劉政海等[17]對美樂葡萄不同營養(yǎng)系酚類研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)系間酚類含量差異顯著，且果實(shí)不同部位酚類物質(zhì)差異顯著。弓志青等[18]對貯藏后的不同板栗總酚和抗氧化活性測定發(fā)現(xiàn)不同品種板栗果仁中總酚、DPPH自由基清除率等抗氧化物之間呈顯著差異，這均與本研究中板栗不同品種間、果實(shí)不同部位酚類及抗氧化劑活性差異顯著結(jié)論一致。AHAD等[19]研究抗氧化劑、溫度、包裝材料和貯存期對核桃酚類的影響，旨在增加核桃品種果實(shí)中的酚類抗氧化活性，提升核桃的保健功效。本研究中通過對15個板栗品種不同部位酚類及抗氧化活性測定，通過主成分分析，得出了板栗桐優(yōu)-33、金豐、石豐品種殼外皮酚類抗氧化活性強(qiáng)，黑煙青、廣西油栗、燕紅為殼內(nèi)膜抗氧化能力較強(qiáng)的品種，桐優(yōu)-33、燕平、雜-35表現(xiàn)果仁抗氧化能力表現(xiàn)較強(qiáng)。李林晴等[20]對河北省9個核桃品種堅果特性進(jìn)行測定，通過主成分分析選出5個適宜河北省栽植的品種。本研究中，15個品種均栽培在河北昌黎，不同品種間酚類及抗氧化活性的差異與環(huán)境有一定關(guān)系[21]，其中板栗桐優(yōu)-33在昌黎地區(qū)殼外皮和果仁中酚類抗氧化物含量均較高，為優(yōu)質(zhì)抗氧化品種資源，且初次研究發(fā)現(xiàn)板栗殼內(nèi)膜總酚含量均在20 mg/g，值得深入開發(fā)加工利用。研究結(jié)論為昌黎地區(qū)栽培高品質(zhì)板栗品種、不同加工板栗品種、分級利用板栗果實(shí)提供理論和材料依據(jù)，提升板栗產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。