海帶、壇紫菜和裙帶菜游離和結合酚抗氧化和酶抑制活性比較

彭春彥，謝星，李一華，胡朋朋，謝作樺，涂宗財,3，張露, *

1(江西師范大學 生命科學學院,國家淡水魚加工技術研發專業中心，江西 南昌，330022)2 (江西德上制藥股份有限公司，江西 樟樹，331200) 3(南昌大學，食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌，330047)

海藻是重要的海洋食物資源，主要分為紅藻、褐藻、綠藻和藍藻四大類，其中紅藻和褐藻是常見的藥食兩用植物，藥理研究表明，紅藻具有解暑、治療咳嗽、高血壓、支氣管炎等功效，褐藻有抗糖尿病和預防心血管疾病等作用[1-3]。壇紫菜(Porphyrahaitanensis)是一種高蛋白、高纖維、低熱值和低脂肪的紅藻，具有抗氧化、抗癌、預防貧血病、胃潰瘍、甲狀腺腫等作用[4-5]。海帶(Laminariajaponica)和裙帶菜(Undariapinnatifida)是常見的褐藻，常被加工成美食，且海帶和裙帶菜在調節免疫、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、降血糖等方面有顯著的效果[6-8]。但目前在壇紫菜、海帶和裙帶菜的研究以多糖、果膠和維生素為主，關于酚類的研究較少。

酚類化合物是植物中主要的活性次級代謝產物，根據存在形式又分為游離酚和結合酚。游離酚易溶于水或極性溶劑，主要存在于細胞的液泡之中，常規浸提的酚以游離酚為主，結合酚常常通過共價鍵和離子鍵與纖維素、蛋白、木質素等大分子緊密結合，需通過酸法、堿法或酶法破壞連接鍵才能釋放[9]。目前已知的結合酚主要為酚酸類，其次為黃酮類化合物，在蔬菜、谷物和豆類中均含有豐富的結合酚，如紅藜麥中結合酚的總酚和總黃酮含量達4.72 mg/g[以沒食子酸當量(gallic acid equivalent，GAE)計]和1.72 mg/g[以蘆丁當量當量(rutin equivalent,RE)]計，為對應游離酚的2.75和1.35倍[10]；綠豆皮中結合酚含量也達到37.64 mg/g[以阿魏酸當量(ferulic acid equivalents，FAE)計][11]。前期研究報道，裙帶菜、馬尾藻等7種藻類的游離和結合酚在胃腸道消化被進一步釋放，且結合酚的總酚含量和抗氧化能力總體上高于游離酚[12]。同時，ONS等[13]發現波西多尼亞海草藻葉中結合酚的總酚和總黃酮含量達407.00 mg GAE/g 和94.40 mg/g[以槲皮素當量(quercetin equivalent，QE)計]，是對應游離酚的1.24和2.11倍，且結合酚具有更好的抗氧化活性。

我們前期比較了海帶、石花菜、裙帶菜和壇子菜中結合酚的含量和抗氧化活性，發現海帶、壇子菜和裙帶菜結合酚具有較好的抗氧化活性。因此，本研究分別采用溶劑萃取法和堿法提取海帶、壇子菜和裙帶菜中的游離酚和結合酚，然后采用紫外分光光度法比較提取物中的總酚和總黃酮含量；采用Fe3+還原能力實驗、DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力實驗評價其抗氧化活性；通過α-葡萄糖苷酶、酪氨酸酶和乙酰膽堿酯酶活性抑制能力實驗評價其在預防和緩解糖尿病、色素沉著和神經疾病方面的應用潛力，旨在為海帶、壇子菜和裙帶菜的高值化利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海帶、壇紫菜和裙帶菜產自威海市，無水乙醇、濃鹽酸、乙酸乙酯、福林酚等，天津市大茂化學試劑廠。DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、槲皮素、沒食子酸、維生素C、曲酸、4-硝基苯基-β-D-葡萄糖酸(4-nitrophenyl β-D-glucopyranoside,pNPG)，上海源葉生物科技有限公司;左旋多巴、加蘭他敏，北京索萊寶科技有限公司;α-葡萄糖苷酶、酪氨酸酶、乙酰膽堿酯酶、二硫代二硝基苯甲酸[5,5′-dithio bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB]、碘代硫化膽堿、阿卡波糖，Sigma試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

RV10型旋蒸儀，德國艾卡儀器設備有限公司；Synergy H1型酶標儀，美國Bio Tek公司；MINI-7G-190917014型離心機，上海邁皋科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

海藻游離酚的提取：將海帶、壇紫菜和裙帶菜粉碎，各取50 g用1 000 mL 70%(體積分數)乙醇溶液浸提24 h，過濾取上清液，重復提取3次，合并上清液。濃縮干后用少量水溶解，然后加入到預先活化的AB-8大孔吸附樹脂柱子中靜態吸附12 h，先用蒸餾水洗脫除去未吸附的糖、蛋白和鹽等，再用80%(體積分數)乙醇洗脫，收集濾液，濃縮干后得到游離酚提取物。

海藻結合酚的提取：將提取游離酚后的海藻殘渣加入到三角瓶中，倒入3倍體積的4 mol/L NaOH溶液，無氧條件下避光反應3 h后，迅速用12 mol/L的鹽酸調節pH為2.0，并用乙酸乙酯萃取，重復萃取3次，濃縮凍干即為結合酚提取物[14]。

1.3.2 總酚含量的測定

采用Folin- Ciocalteu法測定海藻樣品的總酚含量[15]。取50 μL樣品或沒食子酸溶液、200 μL 70%乙醇與1.0 mL 10% Folin-Ciocalteu試劑混勻，反應5 min后加入750 μL 20%(質量分數)的Na2CO3溶液室溫避光反應30 min，最后于765 nm處測吸光值，以70%乙醇代替樣液為空白對照，蒸餾水代替Na2CO3溶液為樣品空白。重復3次，以沒食子酸濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線(Y=0.004 2X-0.004 1，R2=0.996 8)，結果以每克干物質中GAE的含量(mg GAE/g)表示。

1.3.3 總黃酮含量的測定

參照趙國玲等[16]的方法測定海藻樣品中的總黃酮含量。取100 μL樣品與100 μL 2%(質量分數)AlCl3·6H2O溶液于96孔酶標板中反應15 min，然后測其在430 nm處的吸光值，用70%乙醇溶液代替AlCl3·6H2O的反應體系為空白對照，以槲皮素為標準品繪制標準曲線(Y=0.020 2X-0.001 8，R2=0.999 9)，結果以每克干物質中QE的含量(mg QE/g)表示。

1.3.4 DPPH自由基清除能力測定

參照PEDRO等[17]的方法測定樣品的DPPH自由基清除能力。取100 μL適宜濃度的海藻樣品與100 μL 0.15 mmol/L DPPH自由基溶液室溫避光反應30 min后，采用酶標儀測其在517 nm處的吸光值，100 μL蒸餾水與100 μL DPPH自由基溶液的反應體系為控制組，100 μL樣品或蒸餾水和100 μL 乙醇的體系分別為樣品空白組和空白組。以維生素C為陽性對照，實驗重復3次，DPPH自由基清除率計算如公式(1)所示：

(1)

式中：Ac為控制組吸光值，Ab為空白組吸光值，As為樣品組吸光值，Aj為樣品空白組吸光值，結果用IC50值表示。

1.3.5 ABTS陽離子自由基清除能力測定

參照陳洪彬等[18]的方法測定海藻樣品的ABTS陽離子自由基清除能力。配制含有2.45 mmol/L過硫酸鉀和7 nmol/L ABTS的ABTS陽離子自由基母液，使用前稀釋為734 nm下的吸光值為0.70±0.20的工作液。取100 μL海藻樣品與100 μL ABTS陽離子自由基工作液于酶標板上混勻，避光反應6 min后測其在734 nm下的吸光值，維生素C作為陽性對照，實驗重復3次。ABTS陽離子自由基清除率計算參照公式(1)，實驗結果用IC50值表示。

1.3.6 鐵離子還原能力測定

參照邢慧穎等[19]的方法測定海藻樣品的鐵離子還原能力。取0.3 mL適宜濃度的樣品或陽性對照品維生素C(2 mg/mL)與0.3 mL 1%(質量分數)的鐵氰化鉀溶液混合，50 ℃反應20 min后加入0.3 mL 10%(質量分數)的三氯乙酸溶液，10 min后加入0.6 mL去離子水和0.12 mL 0.1%(質量分數)氯化鐵，搖勻后取200 μL上清液于96孔酶標板中測其在700 nm處的吸光值，反應液中以0.12 mL蒸餾水代替0.1%的氯化鐵做空白組，吸光值越大表明還原能力越強。

1.3.7 α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

參照前期方法[15]測定樣品的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力。50 μL樣品和50 μL(0.2 U/mL)α-葡萄糖苷酶反應10 min，加入50 μLpNPG 37 ℃下孵育30 min后加入100 μL Na2CO3溶液終止反應，并測其在405 nm處的吸光值。PBS替代樣品為控制組(Ac)、PBS代替pNPG的反應體系為樣品空白組(Aj)。以阿卡波糖為陽性對照，實驗重復3次。抑制率參照公式(1)計算，結果以IC50表示。

1.3.8 酪氨酸酶抑制活性測定

參照JESUMANI等[20]的方法測定樣品抑制酪氨酸酶的能力。50 μL樣品和50 μL酪氨酸酶(100 U/mL)室溫反應15 min，加入50 μL左旋多巴(2.5 mmol/L)，室溫反應10 min后于475 nm處測定吸光值。反應液中以PBS替代樣品為控制組(Ac)、PBS代替左旋多巴為樣品空白組(Aj)、PBS替代樣品和酪氨酸酶為空白組(Ab)。曲酸作為陽性對照，實驗重復3次，酪氨酸酶抑制率參照公式(1)計算，結果用IC50表示。

1.3.9 乙酰膽堿酯酶抑制活性測定

參照PEDRO等[17]的方法評價樣品的乙酰膽堿酯酶抑制能力。取50 μL樣品與125 μL 3 mmol/L DTNB(用0.1 mol/L pH 7.0 PBS配制)和25 μL 0.3 U/mL乙酰膽堿酯酶(20 mmol/L，pH 7.5 Tris-HCl溶液配制)混勻室溫反應15 min，然后加入25 μL 5.0 mmol/L碘代硫化膽堿反應10 min，最后測定反應體系在412 nm處的吸光值。同時設置控制組(Ac)、空白組(Ab)和樣品空白組(Aj)，以加蘭他敏為陽性對照，實驗重復3次。乙酰膽堿酯酶抑制率參照公式(1)，結果用IC50表示。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 總酚含量

海帶、壇紫菜和裙帶藻干原料中游離酚和結合酚含量見表1。總體來說，3種海藻中的結合酚含量均高于游離酚，其中壇紫菜結合酚中的總酚含量最高，為863.53 μg GAE/g DW，其次為裙帶菜和海帶結合酚，含量分別為819.67、692.05 μg GAE/g DW。同時，壇紫菜也具有最高的游離酚含量，總酚含量為409.45 μg GAE/g DW，海帶中的游離酚含量最低，為27.99 μg GAE/g DW。KANG等[21]報道表明海帶中游離酚的含量為120 μg GAE/g DW，略高于本研究中游離酚含量，但顯著低于結合酚含量。這可能是因為海藻的產地、采集季節和提取方式不同所致。不同海藻中總酚含量比較研究表明，海藻品種和提取方式是影響其總酚含量的重要因素[22]。

2.2 總黃酮含量

3種海藻游離酚和結合酚中的總黃酮含量如表1所示，不同樣品間的總黃酮含量存在顯著性差異(P<0.05)，海帶和壇紫菜結合酚中的總黃酮含量均高于游離酚，但裙帶菜游離酚中的總黃酮含量高于結合酚。裙帶菜游離酚的總黃酮含量最高，為49.31 μg QE/g DW，約為海帶游離酚中的8倍(6.25 μg QE/g DW)，其次為海帶和裙帶菜結合酚，含量分別為38.06、34.18 μg QE/g DW(P>0.05)，但在壇紫菜游離多酚提取物中未檢測出黃酮類化合物。

表1 海帶、壇紫菜、裙帶菜游離和結合酚提取物的總酚和總黃酮含量

2.3 DPPH自由基清除能力

如圖1所示，3種海藻的游離酚和結合酚提取物的DPPH自由基清除能力均隨著樣品濃度的增加而不斷增強，呈現出顯著的劑量效應。由表2可知，海帶結合酚提取物的DPPH自由基清除能力最強，IC50值為401.19 μg/mL，裙帶菜結合酚提取物次之；海帶和裙帶菜游離酚提取物的活性最弱(P>0.05)。3種海藻結合酚提取物的DPPH自由基清除能力均顯著強于游離酚提取物，這與其總酚含量變化趨勢是一樣的，但所有樣品的DPPH自由基清除能力均低于維生素C(表2)。海帶游離酚提取物的DPPH自由基清除能力與汪群等[6]報道一致，IC50均大于2.0 mg/mL，但壇紫菜游離酚提取物的DPPH自由基清除能力低于趙國玲等[16]報道的結果。DPPH自由基與總酚含量相關性系數為0.896，表明多酚可能在其中起到主要的作用。

圖1 海帶、壇紫菜、裙帶菜游離和結合酚提取物的DPPH自由基清除能力

表2 海帶、壇紫菜、裙帶菜游離和結合酚提取物抗氧化和酶抑制能力的半抑制濃度 單位：μg/mL

2.4 ABTS陽離子自由基清除能力

如圖2和表2所示，3種海藻酚提取物均能顯著清除ABTS陽離子自由基，且不同海藻樣品的活性與其濃度有明顯的量效關系。壇紫菜游離酚提取物的ABTS陽離子自由基清除能力最強，是對應結合酚的2.86倍，可能含有較多的具有ABTS陽離子自由基清除能力的酚類化合物。陳洪彬等[18]也發現壇紫菜游離酚具有很強的ABTS陽離子自由基清除能力，IC50值達16.07 μg/mL，總酚含量為6.91 mg GAE/g。海帶和裙帶菜結合酚提取物的ABTS陽離子自由基的清除能力均顯著高于對應的游離酚提取物，但海帶和裙帶菜結合酚提取物清除ABTS陽離子自由基的IC50值無顯著性差異(P>0.05)。陽性對照維生素C對ABTS陽離子自由基清除能力遠高于3種海藻提取物，其IC50達19.13 μg/mL。相關性分析表明，ABTS陽離子自由基清除能力與總酚含量呈正相關而與總黃酮含量呈負相關，相關系數分別為0.36和-0.438。

圖2 海帶、壇紫菜、裙帶菜游離和結合酚提取物的ABTS陽離子自由基清除能力

2.5 鐵離子還原能力

吸光值越高則表示海藻游離和結合酚提取物的鐵離子還原能力越強。由圖3可知，3種海藻結合酚提取物的鐵離子還原能力顯著強于游離酚提取物，結合酚提取物的吸光值為0.319～0.302，游離酚提取物的吸光值為0.021～0.123。海帶和裙帶菜結合酚提取物的Fe3+還原能力無顯著性差異(P>0.05)，吸光值均為0.319，壇紫菜游離酚提取物的鐵離子還原能力分別是海帶和裙帶菜游離酚提取物的5.85和1.78倍，這可能與其有更高的總酚含量有關。趙國玲等[16]也報道壇紫菜游離酚組分具有鐵離子還原能力，且在1.5 g/L質量濃度下吸光值可達0.50。但3種藻類多酚提取物的鐵離子還原能力均低于維生素C。

圖3 海帶、壇紫菜、裙帶菜游離和結合酚提取物的鐵離子還原能力

2.6 α-葡萄糖苷酶抑制活性

α-葡萄糖苷酶是一種重要的糖苷鍵水解酶，能水解蔗糖、麥芽糖等寡糖為可吸收的單糖，研究發現，抑制α-葡萄糖苷酶的活性能改善餐后和空腹血糖水平，達到預防和治療糖尿病的效果。臨床上用的α-葡萄糖苷酶抑制劑如阿卡波糖有腸胃脹氣、腹瀉等副作用，而天然來源的α-葡萄糖苷酶抑制劑有高效、低毒和副作用小等優勢，是目前糖尿病領域研究的熱點和重點[23]。因此，測定海帶、壇紫菜、裙帶菜游離和結合酚的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力可評估其在降血糖方面的應用潛力。

如圖4和表2所示，3種海藻多酚提取物均有α-葡萄糖苷酶抑制能力，且結合酚提取物的活性顯著高于游離酚提取物，其中裙帶菜結合酚提取物的α-葡萄糖苷酶抑制能力最強，其IC50值為156.52 μg/mL，略低于阿卡波糖(199.72 μg/mL)。裙帶菜和海帶結合酚提取物的活性是對應游離酚提取物的7.75和3.49倍。以上結果表明，3種海藻結合酚提取物，尤其是裙帶菜提取物，是α-葡萄糖苷酶抑制劑的優質來源。KANG等[21]研究發現海帶多酚提取物對α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值大于8 mg/mL，顯著高于我們的研究，且其總酚含量與其活性呈高度的相關性。α-葡萄糖苷酶抑制活性與總酚和總黃酮含量的相關系數分別為0.239和-0.669，表明其與總酚呈正相關，而與總黃酮為負相關。

圖4 海帶、壇紫菜、裙帶菜游離和結合酚提取物的α-葡萄糖苷酶抑制能力

2.7 酪氨酸酶抑制能力

酪氨酸酶是人體中黑色素合成的重要酶，抑制其活性可減少老年斑、雀斑、黃褐斑及皮膚惡性黑色素腫瘤等疾病的發生率，常見的酪氨酸酶抑制劑，如曲酸、氫醌等雖然可達到美白、祛斑等目的，但長期使用會產生皮炎、皮膚過敏甚至皮膚癌等副作用[24]。因此，分析3種海藻游離和結合酚提取物的酪氨酸酶抑制活性可評估其在皮膚病治療方面的應用價值。如圖5和表2所示，3種海藻游離和結合酚提取物對酪氨酸酶的抑制能力均隨著濃度的增加而增加，呈現出劑量效應，但活性均低于陽性對照品曲酸，在結合酚提取物中，不同海藻結合酚提取物的酪氨酸酶抑制活性差異顯著，海帶結合酚提取物的IC50值最低，為196.28 μg/mL，表明其酪氨酸酶抑制活性最強。3種海藻游離酚提取物的IC50值為367.43～524.47 μg/mL，壇紫菜和裙帶菜游離酚提取物的酪氨酸酶抑制能力無顯著性差異(P>0.05)。以上結果表明海帶結合酚提取物作為酪氨酸酶抑制劑的開發潛力最大，這可能與其富含阿魏酸[25]、香草酸[26]等活性成分有關[27]。相關性分析表明，酪氨酸酶抑制能力與總酚含量顯著相關。

圖5 海帶、壇紫菜、裙帶菜游離和結合酚提取物的酪氨酸酶抑制能力

2.8 乙酰膽堿酯酶抑制能力

乙酰膽堿酯酶是神經傳導過程中的關鍵酶，通過水解乙酰膽堿為膽堿和乙酸來阻斷神經信號傳遞，抑制其活性能預防老年性癡呆等神經性疾病的發生[24]。因此，測定海帶、壇紫菜、裙帶菜游離和結合酚提取物的乙酰膽堿酯酶抑制活性可評估其在治療和預防神經類疾病藥物方面的作用。由圖6和表2可知，3種海藻游離和結合酚提取物抑制乙酰膽堿酯酶的IC50值的順序為壇紫菜游離酚提取物(913.83 μg/mL)>海帶游離酚提取物(833.33 μg/mL)>裙帶菜游離酚提取物(752.00 μg/mL)>海帶結合酚提取物(453.37 μg/mL)>壇紫菜結合酚提取物(452.95 μg/mL)>裙帶菜結合酚提取物(289.46 μg/mL)。3種海藻結合酚提取物的乙酰膽堿酯酶抑制活性顯著強于游離酚，其中裙帶菜結合酚提取物的乙酰膽堿酯酶抑制能力最強。裙帶菜游離酚和結合酚提取物的乙酰膽堿酯酶活性強于PEDRO等[17]報道的裙帶菜酶解產物(IC50，1 000 μg/mL)。乙酰膽堿酯酶抑制能力與總酚和總黃酮含量的相關系數分別為0.623和0.962，表明酚酸和黃酮均對裙帶菜、壇子菜和海帶的乙酰膽堿酯酶抑制能力有貢獻。

圖6 海帶、壇紫菜、裙帶菜游離和結合酚提取物的乙酰膽堿酯酶抑制活性

3 結論

3種海藻原料中結合酚的總酚含量顯著高于游離酚。除裙帶菜外，3種海藻原料中結合酚中的總黃酮含量均高于游離酚。抗氧化實驗證明，壇紫菜游離酚提取物的ABTS陽離子自由基清除能力最強；海帶和裙帶菜結合酚提取物的DPPH自由基清除能力和鐵離子還原能力顯著強于其他海藻酚組分。酶抑制實驗表明，海帶結合酚提取物的酪氨酸酶抑制能力最強；裙帶菜結合酚提取物的α-葡萄糖苷酶和乙酰膽堿酯酶的抑制能力更具優勢。酚類組分是3種海藻提取物中主要的DPPH自由基、酪氨酸酶和乙酰膽堿酯酶抑制成分，黃酮是3種海藻提取物中α-葡萄糖苷酶抑制成分。綜上所述，相比于其他兩種海藻，海帶作為抗氧化劑和酪氨酸酶抑制劑的開發潛力更大，且裙帶菜是α-葡萄糖苷酶和乙酰膽堿酯酶抑制劑的最優質原料來源，具有開發治療與其相關疾病的健康食品的潛力。