發(fā)酵性絲孢酵母胞內(nèi)脂肪酶與蛋白酶性質(zhì)的研究

許燕博,　王　迪,　侯英敏,　孫玉梅,　王寧涵

大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，大連市 116034

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發(fā)酵性絲孢酵母胞內(nèi)脂肪酶與蛋白酶性質(zhì)的研究

許燕博,王迪,侯英敏,孫玉梅*,王寧涵

大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，大連市 116034

摘要：為了探討發(fā)酵性絲孢酵母胞內(nèi)脂肪酶和蛋白酶的潛在應(yīng)用，通過超聲波破碎細(xì)胞獲得胞內(nèi)酶，研究了溫度、pH、金屬離子、有機(jī)溶劑、表面活性劑、蔗糖、淀粉、酪蛋白對(duì)粗酶液的酶活力的影響。研究結(jié)果表明，兩種酶的最適反應(yīng)條件均為55 ℃、pH中性；5 mmol/L的金屬離子Ca2+、Mn2+降低了脂肪酶活力，而提高了蛋白酶的活力；20%(v/v)甲醇、乙醇、異丙醇、正己烷、甲苯對(duì)脂肪酶均具有激活作用，其中正己烷激活作用最大；而所試有機(jī)溶劑均嚴(yán)重抑制蛋白酶活力；0.01%(v/v)TritonX-100和蔗糖7.5%(w/v)對(duì)脂肪酶和蛋白酶均具有激活作用，0.5%(w/v)可溶性淀粉和1%～2.5%(w/v)酪蛋白均能提高脂肪酶活力且降低蛋白酶活力。這些特性使發(fā)酵性絲孢酵母胞內(nèi)脂肪酶和蛋白酶應(yīng)用于洗滌劑具有可能性。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵性絲孢酵母； 脂肪酶； 蛋白酶； 酶學(xué)性質(zhì)

微生物脂肪酶和蛋白酶被廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。有些工業(yè)生產(chǎn)需要脂肪酶和蛋白酶的共同作用，比如：洗滌劑中同時(shí)添加脂肪酶和蛋白酶可以起到更好的去污效果[1]，皮革軟化需要脂肪酶和蛋白酶共同作用才能達(dá)到理想效果[2]，肉制品加工中脂肪酶和蛋白酶可促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生等[3]。

能單獨(dú)產(chǎn)脂肪酶和蛋白酶的微生物較多，而假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、青霉菌屬、絲孢酵母屬等微生物能同時(shí)產(chǎn)脂肪酶和蛋白酶[1,3-5]。利用微生物同時(shí)生產(chǎn)脂肪酶和蛋白酶，可通過一次發(fā)酵生產(chǎn)過程滿足同時(shí)需要兩種酶的應(yīng)用領(lǐng)域的需求，比單獨(dú)生產(chǎn)兩種酶的成本要低。

通過菌種篩選并優(yōu)化發(fā)酵條件，提高了相關(guān)微生物同時(shí)產(chǎn)脂肪酶和蛋白酶的能力[1,3-5]。為了使脂肪酶和蛋白酶能更好用于實(shí)際生產(chǎn)，必須了解二者的酶學(xué)性質(zhì)。目前僅對(duì)綠膿假單胞菌和地衣芽孢桿菌所產(chǎn)脂肪酶及蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)研究比較全面，包括溫度、pH、儲(chǔ)存條件、變性劑、氧化劑、有機(jī)溶劑、表面活性劑、金屬螯合劑等對(duì)酶活的影響[1,4]。發(fā)酵性絲孢酵母能產(chǎn)油脂和脂肪酶[6-9]，目前尚無關(guān)于其所產(chǎn)脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)以及產(chǎn)蛋白酶的報(bào)道。

本文對(duì)發(fā)酵性絲孢酵母脂肪酶與蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，包括溫度、pH、金屬離子、有機(jī)溶劑、表面活性劑、蔗糖、淀粉、酪蛋白對(duì)酶活力的影響，為開發(fā)該菌胞內(nèi)脂肪酶和蛋白酶的工業(yè)應(yīng)用提供了可能性。

1材料與方法

1.1菌種

發(fā)酵性絲孢酵母(Trichosporonfermentans)CICC1368：購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2培養(yǎng)基

固體斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，瓊脂20，pH自然。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖100.0，蛋白胨5.3，酵母粉2.0，尿素2.0，MgSO4·7H2O 0.5，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖100.0，蛋白胨1.8，酵母粉0.5，KH2PO42.0，植物油8.5，吐溫-80 4.6，pH自然。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞的培養(yǎng)

將4 ℃保存的發(fā)酵性絲孢酵母菌種接種于固體斜面培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)48 h。取斜面培養(yǎng)的菌絲接入種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、160 r/min 搖床培養(yǎng)24 h。向發(fā)酵培養(yǎng)基中接入10%(v/v)的種子液，于30 ℃、160 r/min搖床發(fā)酵60 h。

1.3.2粗酶液的制備

發(fā)酵液于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集菌體，用0.067 mol/L、pH 6.8的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體3次，離心收集菌體。稱取1 g收集所得的菌體與25 mL磷酸鹽緩沖液混合，于冰水浴中進(jìn)行超聲波破碎(550 w，6 s/5 s，5.5 min)，將細(xì)胞破碎液于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清液，上清液即為粗酶液。

1.3.3脂肪酶活力測定

采用酸堿滴定法[10]測定脂肪酶活力。

脂肪酶活力定義：在38 ℃、pH 6.8的反應(yīng)條件下，將每分鐘脂肪酶催化橄欖油水解產(chǎn)生1 μmol脂肪酸所需酶量定義為一個(gè)脂肪酶活力單位。發(fā)酵60 h時(shí)，脂肪酶活力為84.1 U/g。

1.3.4蛋白酶活力測定

采用福林法[11]測定蛋白酶活力。

蛋白酶活力定義：在40 ℃、pH 6.8的反應(yīng)條件下，將每分鐘蛋白酶催化酪蛋白水解產(chǎn)生1 mg酪氨酸所需酶量定義為一個(gè)蛋白酶活力單位。發(fā)酵60 h時(shí)，蛋白酶活力為308.8 U/g。

1.3.5反應(yīng)溫度、反應(yīng)pH值對(duì)脂肪酶與蛋白酶活力的影響

分別將粗酶液置于不同溫度、pH下測定脂肪酶和蛋白酶活力。

1.3.6金屬離子對(duì)脂肪酶與蛋白酶活力的影響

在粗酶液中分別加入終濃度5 mmol/L的各種金屬離子鹽溶液(CaSO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O)，室溫保存30 min，在各自最適條件下，測定其脂肪酶和蛋白酶活力。以未經(jīng)金屬離子鹽溶液處理的粗酶液為對(duì)照，將最適反應(yīng)條件下脂肪酶和蛋白酶活力各自定義為100%。

1.3.7有機(jī)溶劑對(duì)脂肪酶與蛋白酶活力的影響

分別將粗酶液與有機(jī)溶劑乙醇、異丙醇、甲苯、甲醇、正丁醇、乙腈、正己烷、環(huán)己烷按體積比4∶1混合，于37 ℃、160 r/min條件下處理30 min，恢復(fù)至室溫，在各自最適條件下，測定其脂肪酶和蛋白酶活力。以未經(jīng)有機(jī)溶劑處理的粗酶液為對(duì)照，將最適反應(yīng)條件下脂肪酶和蛋白酶活力各自定義為100%。

1.3.8表面活性劑對(duì)脂肪酶與蛋白酶活力的影響

在粗酶液中分別加入終濃度0.01%(v/v)的表面活性劑TritonX-100、Tween-40、Tween-80、CTAB、SDS，室溫保存30 min，在各自最適條件下，測定其脂肪酶和蛋白酶活力。以未經(jīng)表面活性劑處理的粗酶液為對(duì)照，將最適反應(yīng)條件下脂肪酶和蛋白酶活力各自定義為100%。

1.3.9酶保護(hù)劑對(duì)脂肪酶與蛋白酶活力的影響

向粗酶液中分別加入終濃度為1%～10%(w/v)的蔗糖、0.5%～5%(w/v)的可溶性淀粉、0.5%～5%(w/v)的酪蛋白，于4 ℃貯存20 h，恢復(fù)至室溫，在各自最適條件下，測定其脂肪酶和蛋白酶活力。以未經(jīng)蔗糖、可溶性淀粉、酪蛋白處理的粗酶液為對(duì)照，將最適反應(yīng)條件下脂肪酶和蛋白酶活力各自定義為100%。

2結(jié)果

2.1反應(yīng)溫度對(duì)脂肪酶與蛋白酶活力的影響

在20 ℃～60 ℃的不同溫度下，分別測定粗酶液的脂肪酶和蛋白酶活力，將最適溫度下的脂肪酶和蛋白酶活力各自定義為100%，由圖1可知，溫度低于55 ℃時(shí)，酶活隨反應(yīng)溫度的升高而增大，在55 ℃時(shí)脂肪酶和蛋白酶的活力均達(dá)到最大值。55 ℃～60 ℃時(shí)，酶活迅速下降。粗酶液的脂肪酶和蛋白酶的最適溫度均為55 ℃。

2.2反應(yīng)pH值對(duì)脂肪酶與蛋白酶活力的影響

在反應(yīng)體系中加入不同pH的磷酸鹽緩沖液，在各自最適反應(yīng)溫度下，測定粗酶液的脂肪酶和蛋白酶活力，將最適pH條件下脂肪酶和蛋白酶活力各自定義為100%，由圖2可知，脂肪酶在酸性和堿性環(huán)境中的酶活均較低，其最適反應(yīng)pH為6.8。而蛋白酶最適pH作用范圍較大，在pH 7～9均能維持較高酶活力，其最適反應(yīng)pH為7.0。

圖1　反應(yīng)溫度對(duì)脂肪酶和蛋白酶活力的影響

圖2　反應(yīng)pH值對(duì)脂肪酶和蛋白酶活力的影響

2.3金屬離子對(duì)脂肪酶與蛋白酶活力的影響

由圖3可知，終濃度為5 mmol/L的Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+對(duì)脂肪酶均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用；除Ca2+、Mn2+外，其余金屬離子對(duì)蛋白酶亦表現(xiàn)出不同程度的抑制作用；Ca2+對(duì)蛋白酶具有明顯的激活作用，使其活力提高了72.19%，且完全抑制脂肪酶。

圖3　金屬離子對(duì)脂肪酶和蛋白酶活力的影響

2.4有機(jī)溶劑對(duì)脂肪酶與蛋白酶活力的影響

由圖4可知，除正丁醇、乙腈、環(huán)己烷對(duì)脂肪酶起抑制作用外，其余有機(jī)溶劑對(duì)脂肪酶均具有激活作用，其中正己烷、異丙醇的激活作用最明顯，使脂肪酶活力提高120%以上；上述有機(jī)溶劑對(duì)蛋白酶均具有不同程度的抑制作用，其中甲醇、乙醇、正丁醇、乙腈、正己烷均完全抑制蛋白酶。

圖4　有機(jī)溶劑對(duì)脂肪酶和蛋白酶活力的影響

2.5表面活性劑對(duì)脂肪酶與蛋白酶活力的影響

由圖5可知，TritonX-100對(duì)脂肪酶和蛋白酶的激活作用最明顯，使兩種酶的相對(duì)酶活分別提高了112.19%和23.03%。除CTAB作用不顯著外，其余表面活性劑對(duì)脂肪酶均具有激活作用，使脂肪酶的相對(duì)酶活均提高了70%以上；CTAB和SDS對(duì)蛋白酶具有抑制作用，Tween-40和Tween-80對(duì)蛋白酶無明顯作用，蛋白酶活力保持不變。因此，添加TritonX-100、Tween-40、Tween-80有利于脂肪酶和蛋白酶的同時(shí)應(yīng)用。

圖5　表面活性劑對(duì)脂肪酶和蛋白酶活力的影響

2.6酶保護(hù)劑對(duì)脂肪酶與蛋白酶活力的影響

2.6.1蔗糖對(duì)脂肪酶與蛋白酶活力的影響

由圖6可知，蔗糖濃度小于7.5%(w/v)時(shí)，脂肪酶活力隨著蔗糖濃度的增加呈上升趨勢；蔗糖濃度為7.5%(w/v)的脂肪酶活力達(dá)到最大，相對(duì)酶活力為205.71%；蔗糖濃度大于7.5%(w/v)時(shí)，脂肪酶活力隨著蔗糖濃度的增加而下降。蛋白酶活力隨蔗糖濃度的增加呈小幅波動(dòng)性變化，蔗糖濃度為7.5%(w/v)的蛋白酶活力達(dá)到最大，相對(duì)酶活力為137.55%。因此，蔗糖作為兩種酶保護(hù)劑的適宜濃度為7.5%(w/v)。

圖6　蔗糖濃度對(duì)脂肪酶和蛋白酶活力的影響

2.6.2可溶性淀粉對(duì)脂肪酶與蛋白酶活力的影響

由圖7可知，隨著可溶性淀粉濃度的增加脂肪酶活力逐漸降低，而蛋白酶活力不斷增加；可溶性淀粉對(duì)脂肪酶的保護(hù)作用的降低，可能與蛋白酶活力的增加有關(guān)；淀粉濃度為0.5%(w/v)的脂肪酶相對(duì)酶活達(dá)到最大為158.9%。因此，淀粉作為脂肪酶保護(hù)劑適宜的濃度為0.5%(w/v)。

圖7　可溶性淀粉濃度對(duì)脂肪酶和蛋白酶活力的影響

2.6.3酪蛋白對(duì)脂肪酶與蛋白酶活力的影響

由圖8可知，酪蛋白濃度小于1%(w/v)時(shí)，隨著酪蛋白濃度的增加，脂肪酶活力顯著增加；酪蛋白濃度為1%～2.5%(w/v)的脂肪酶活力最大，相對(duì)酶活增加了約96%；酪蛋白濃度大于2.5%(w/v)時(shí)，脂肪酶活力隨著酪蛋白濃度的增加呈下降趨勢。蛋白酶活力隨酪蛋白濃度的增加顯著下降，大于2.5%(w/v)的酪蛋白濃度可使蛋白酶完全喪失活力。因此，酪蛋白作為脂肪酶保護(hù)劑的適宜濃度為1%～2.5%(w/v)。

圖8　酪蛋白濃度對(duì)脂肪酶和蛋白酶活力的影響

3討論

研究脂肪酶和蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)對(duì)于評(píng)估其工業(yè)應(yīng)用具有重要的作用。作為洗滌劑添加劑，酶制劑要耐受高溫和堿性環(huán)境。目前常用來生產(chǎn)酶制劑的地衣芽孢桿菌脂肪酶和蛋白酶的最適反應(yīng)溫度分別為55 ℃和45 ℃，最適反應(yīng)pH均為9[4]；綠膿假單胞菌脂肪酶和蛋白酶的最適反應(yīng)溫度分別為70 ℃和60 ℃，最適反應(yīng)pH分別為11和9[1]。與這兩種菌相比，發(fā)酵性絲孢酵母脂肪酶和蛋白酶均有良好的耐高溫能力，蛋白酶耐堿性良好，而脂肪酶的耐堿能力較差。

酶制劑除了要耐高溫耐堿以外，還要耐受洗滌劑及其中添加的一些成分(比如助溶劑等)[12]以及洗滌用水中的一些成分(比如金屬離子等)。綠膿假單胞菌脂肪酶和蛋白酶在2%(v/v)TritonX-100條件下處理1 h，脂肪酶被激活，蛋白酶活力基本不變；地衣芽孢桿菌脂肪酶和蛋白酶用2%(v/v)TritonX-100處理20 min后活力均保持穩(wěn)定，用0.5%(v/v)正己烷、異丙醇處理1 h后，酶活力基本不變。兩種微生物所產(chǎn)酶均能在含有表面活性劑和有機(jī)溶劑的環(huán)境中保持酶活。與之相比，本研究中發(fā)酵性絲孢酵母脂肪酶和蛋白酶用0.01%(v/v)TritonX-100處理30 min后脂肪酶和蛋白酶活力均明顯激活，有利于發(fā)酵性絲孢酵母脂肪酶和蛋白酶的同時(shí)應(yīng)用。20%(v/v)正己烷、異丙醇均能夠明顯地激活脂肪酶的活力而抑制蛋白酶活力。金屬離子Ca2+、Mn2+能夠激活蛋白酶但對(duì)脂肪酶不利。生產(chǎn)過程中為了保證脂肪酶和蛋白酶的活性，可添加7.5%(w/v)蔗糖作為酶的保護(hù)劑。若將發(fā)酵性絲孢酵母胞內(nèi)脂肪酶和蛋白酶應(yīng)用于洗滌劑中，需要在洗滌劑中加入水軟化劑，以免水中金屬離子對(duì)酶產(chǎn)生鈍化作用。

4結(jié)論

發(fā)酵性絲孢酵母產(chǎn)生的脂肪酶與蛋白酶最適溫度均為55 ℃，最適pH分別為6.8和7.0。濃度為5 mmol/L的金屬離子Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+和Cu2+分別對(duì)脂肪酶均產(chǎn)生抑制作用，而Ca2+和Mn2+能夠激活蛋白酶。0.01%(v/v)TritonX-100、7.5%(w/v)蔗糖對(duì)脂肪酶和蛋白酶均具有激活作用。20%(v/v)甲醇、乙醇、異丙醇、正己烷、甲苯對(duì)脂肪酶均具有激活作用，其中正己烷激活作用最大；而所試有機(jī)溶劑均嚴(yán)重抑制蛋白酶活力。0.5%(w/v)可溶性淀粉和1%～2.5%(w/v)酪蛋白使脂肪酶活力提高，能夠有效保護(hù)脂肪酶活力而不利于保護(hù)蛋白酶活力。可見，發(fā)酵性絲孢酵母胞內(nèi)脂肪酶和蛋白酶均耐高溫，對(duì)表面活性劑也有一定耐受能力，蛋白酶耐堿，7.5%(w/v)蔗糖可作為二者的酶保護(hù)劑，把該兩種酶作為洗滌用酶具有可能性。

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doi:10.3969 /j.issn.1001-6678.2016.03.004

基金項(xiàng)目：遼寧省科技廳2014年自然科學(xué)基金項(xiàng)目優(yōu)秀人才培育專題(2014026013)。

作者簡介：許燕博(1989～)，女，碩士研究生。E-mail：xuyanbo1031@163.com。

*通訊作者：孫玉梅(1962～)，女，教授。

Characterization of lipase and protease from Trichosporon fermentans

XU Yan-bo, WANG di, HOU Ying-min, SUN Yu-mei, WANG Ning-han

School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034

AbstractFor researching the potential application of intracellular lipase and protease from Trichosporon fermentans, the influences of temperature, pH, cations, organic solvents, surfactants, sucrose, starch and casein on activities of enzymes were studied. The intracellular enzymes were obtained by ultrasonication. The results revealed that lipase and protease showed the maximum activities at 55 ℃ and neutral pH. The lipase activity was reduced while the protease activity could be partially increased by 5 mmol/L Ca2+and Mn2+. The lipase was stimulated by 20%(v/v)methanol, ethanol, isopropanol, n-hexane and toluene, to the highest activity by n-hexane. And the protease was strongly inhibited by all the tested organic solvent. The activities of lipase and protease were increased in the presence of 0.01% (v/v) TritonX-100 and 7.5% (w/v) sucrose. It was revealed that 0.5% (w/v) amylodextrine and 1%～2.5% (w/v) casein could activate lipase but inhibit protease. These characteristics provided the potential application of the lipase and protease from Trichosporon fermentans in detergents.

Key wordsTrichosporon fermentans; lipase; protease; characteristics