一株雞源沙門氏菌的分離鑒定及藥敏試驗

熊菊萍，肖瀅宇，王 穩，韓青松，高小龍，李增魁，文 英，仝麗娜*

（1.青海大學農牧學院 810000；2.溫州科技職業學院 325006）

沙門氏菌（Salmonella）為革蘭氏陰性兼厭氧桿菌，屬于腸桿菌科沙門氏菌屬，不形成芽孢﹑多數無莢膜﹑多單個存在[1]。該菌通常寄生在動物的腸道中，對大部分動物均有致病性，能引起多種動物的沙門氏菌病，癥狀以腹瀉和敗血癥等為主。同時，沙門氏菌是人類細菌性食物中毒的主要病原之一，在人醫﹑獸醫和公共衛生上具有重要意義[2]。該菌血清型眾多，目前已鑒定出2500多種[3]。常見的雞沙門氏菌病有雞白痢﹑雞傷寒以及雞副傷寒，分別由雞白痢沙門氏菌﹑雞傷寒沙門氏菌和其他具有運動性的沙門氏菌（主要為腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌）引起。沙門氏菌感染雛雞后，可導致嚴重腹瀉，死亡率較高，感染成雞后，可引起腹膜炎﹑輸卵管炎或造成隱性感染等[4,5]，造成生產性能和蛋品質降低，并且該菌可垂直傳播，對養禽業危害巨大[6]。抗生素的應用，不僅有效降低和緩解了畜禽包括沙門氏菌病在內的多種細菌病毒防控的壓力，也起到了促進動物生長的作用，然而隨著養殖場抗生素類藥物的廣泛﹑持續﹑不合理﹑不規范使用甚至濫用，使沙門氏菌對抗生素類藥物的耐藥性越來越普遍，多重耐藥菌株不斷出現[7,8]。因此，調查了解沙門氏菌耐藥性狀況，對指導我省養雞場合理用藥具有重要意義。2020年10月，青海湟源縣某散養雞場部分雛雞發病，病雞精神沉郁﹑劇烈腹瀉，后期死亡。為確定病雞死亡原因，本研究無菌采集病死雞臟器病料，分離到一株疑似菌，經革蘭氏染色鏡檢﹑生化鑒定﹑16S rRNA基因擴增和測序后，鑒定為沙門氏菌，并對分離菌進行了致病性試驗和藥敏試驗，旨在為本地區雞沙門氏菌病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料

病料來自青海省湟源縣某蛋雞場病死雞。

1.2 主要試劑

營養瓊脂培養基﹑MH瓊脂培養基購自杭州微生物試劑有限公司；SS瓊脂﹑細菌微量生化鑒定管和抗菌藥物藥敏紙片購自青島海博生物技術有限公司；革蘭氏染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；膠回收試劑盒和DL 2000 DNA Maker購自天根生化科技有限公司；2×EasyTaq PCR SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司；營養肉湯購自北京奧博星生物技術有限公司；麥氏比濁管購自溫州市康泰生物科技有限公司。

1.3 試驗動物

1周齡SPF雞購自寧波純派農業科技有限公司。

1.4 分離培養與鏡檢

采用無菌操作，將采集的肝臟﹑脾臟樣品進行沙門氏菌的分離純化及鑒定。以平板劃線法將樣品接種于普通營養瓊脂和SS瓊脂培養基，于恒溫培養箱內37℃培養約24 h。用接種環挑取平板上生長的菌落至SS瓊脂培養基進行純化培養。

用無菌接種環挑取1～2環生理鹽水于載玻片中央，再用滅菌后的接種環挑取純化培養后的沙門氏菌疑似菌落的單個菌落，與載玻片中央的生理鹽水混勻，將混合物涂布至直徑1cm左右的薄層，室溫干燥后用酒精燈加熱玻片固定菌。瑞氏染色法將制好的玻片染色，用電子顯微鏡觀察菌體的形態特征。

1.5 生化鑒定

用無菌接種環或棉簽將上述純化培養后的菌落接種于色氨酸肉湯﹑賴氨酸脫羧酶﹑尿素酶﹑氰化鉀﹑山梨醇﹑水楊苷﹑丙二酸鹽﹑衛矛醇半固體﹑ONPG﹑甘露醇細菌生化鑒定管內，置于恒溫培養箱內37℃培養18～24 h。參考《伯杰細菌鑒定手冊》判定生化鑒定結果。

1.6 細菌16S rRNA基因擴增

水煮法提取分離純化后的沙門菌DNA。設計16S rRNA 基因 引 物，16S rRNA-F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，16SrRNA-R: 5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA3’，目的片段1500 bp。以提取的沙門氏菌DNA為模板，進行PCR擴增，反應體系為：2×Taq Mix 25μL﹑上下游引物各1μL﹑模板2μL，ddH2O將體系補至50μL。反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min。將PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段切下后用膠回收試劑盒進行膠回收，將膠回收產物送至上海生工生物有限公司測序，測序結果在NCBI進行BLAST比對。

1.7 雛雞致病性試驗

將10只1周齡SPF雛雞分為兩組，每組各5只，第一組為試驗組，第二組為對照組。第一組試驗組的雛雞腹腔注射1mL麥氏比濁度為1的分離菌菌液，第二組試驗對照組腹腔注射1mL無菌的營養肉湯。每12h觀察一次各組雛雞的健康狀況和死亡情況。將死亡的雛雞進行尸體剖檢，觀察其內臟病變并采集臟器進行細菌的分離鑒定。

1.8 藥敏試驗

采用K-B紙片擴散法進行藥敏試驗。將純化的細菌接種到SS培養基上，37℃培養24h，挑取單個菌落接種于5mL營養肉湯中，37℃﹑220 r/min搖床培養14h。用滅菌PBS調節菌液濃度至0.5麥氏比濁度。用滅菌棉簽將稀釋好的菌液均勻涂布于MH瓊脂平板上，放置5min后貼上藥敏紙片。將培養皿倒置放入恒溫培養箱，37℃培養24～48h。測量抑菌圈直徑。

2 結果

2.1 細菌的形態特征和鏡檢結果

從該雞場病料中分離的細菌在SS瓊脂培養基上呈現半透明﹑表面光滑﹑邊緣整齊的圓形菌落（圖1A）；革蘭染色鏡檢為紅色﹑長短不一的短桿菌，判斷為革蘭陰性菌（圖1B）。

圖1 分離菌株菌落形態和革蘭氏染色鏡檢結果

2.2 生化試驗

分離菌接種微量生化鑒定管后，生化鑒定結果如表1所示，賴氨酸脫羧酶﹑山梨醇﹑水楊苷和甘露醇試驗呈陽性；色氨酸肉湯﹑尿素酶﹑氰化鉀﹑丙二酸鹽﹑衛矛醇半固體﹑ONPG試驗反應呈陰性，與《伯杰細菌鑒定手冊》中沙門氏菌的生化特征相符合。

表1 生化鑒定結果

2.3 細菌16S rRNA和invA基因擴增

以水煮法制備的分離菌DNA為模板，用16S rRNA引物進行PCR擴增，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示成功擴增出1500 bp的16S rRNA基因條帶（圖2）。切膠回收1500 bp的16S rRNA條帶，膠回收產物送至上海生工生物有限公司測序，測序結果在GenBank公布的序列進行BLAST比對，結果顯示與沙門氏菌同源性最高，為99.53%。由以上結果可判定該菌株為沙門氏菌。

圖2 16S rRNA 基因 PCR 擴增結果

2.4 雛雞致病性試驗

試驗組雛雞在腹腔接種菌液后12h開始發病，36h后出現死亡，48h后全部死亡。將死亡雛雞解剖后從臟器中成功分離出沙門氏菌；第二組對照組所有雛雞均狀況良好，無死亡狀況。以上結果表明，該分離菌具有致病性。

2.5 藥敏試驗

根據藥敏試驗結果判定標準，藥敏試驗結果如表2所示，該菌株對阿莫西林﹑頭孢唑啉﹑頭孢噻肟﹑丁胺卡那﹑卡那霉素﹑四環素﹑多西環素﹑環丙沙星﹑氧氟沙星﹑蒽諾沙星﹑氯霉素﹑多粘菌素B﹑氟苯尼考敏感，對萬氨芐西林﹑慶大霉素﹑鏈霉素﹑萬古霉素和利福平有耐藥性。

表2 藥敏試驗結果

3 討論

雞沙門菌病可通過多種途徑進行傳播，可水平傳播，也可通過種蛋垂直傳播，對養禽業危害較大[9]。為查明湟源縣某蛋雞場病雞發病原因，本研究無菌采集病雞臟器樣品后，進行常規細菌分離培養。為達到快速﹑準確鑒定疑似菌目的，從臟器分離出疑似菌后，先進行了16S rRNA基因擴增和測序。測序結果與GenBank中公布的序列進行Blast比對分析后，發現分離菌與沙門氏菌同源性最高，為99.34%。隨后，對分離菌進行了革蘭氏染色，并接種沙門氏菌微量生化鑒定管，革蘭氏染色鏡檢和生化鑒定結果進一步確認分離菌為沙門氏菌。后期將對分離的此株沙門氏菌進行進一步血清學分型鑒定。為確定該分離菌為致病菌，接種1周齡SPF小雞進行攻毒試驗，攻毒后小雞均發病死亡，并且從病死雞臟器中分離出該菌，表明此菌為該雞場此次疫情的病原。抗生素作為控制細菌病感染的一種有效手段，在臨床上得到了廣泛應用。但由于抗生素的不合理使用，導致了越來越多的細菌產生了耐藥性，多重耐藥的沙門氏菌也不斷從雞場分離出來[10-12]，一定程度上增加了細菌病防控難度。為指導合理用藥，本研究評價了該株沙門氏菌的耐藥性，選擇8大類18種藥物進行藥敏試驗，結果顯示該菌株對阿莫西林﹑頭孢唑啉﹑頭孢噻肟﹑丁胺卡那﹑卡那霉素﹑四環素﹑多西環素﹑環丙沙星﹑氧氟沙星﹑蒽諾沙星﹑氯霉素﹑多粘菌素B﹑氟苯尼考敏感，對萬氨芐西林﹑慶大霉素﹑鏈霉素﹑萬古霉素和利福平有耐藥性，表明該菌株對頭孢類﹑四環素類﹑喹諾酮類﹑氯霉素類藥物敏感，而對青霉素類﹑氨基糖甙類和多肽類等多種藥物產生了耐藥性，且為多重耐藥。與先前學者報道的一致，禽源沙門氏菌對常用抗菌藥耐藥情況較嚴重[10,11]。細菌耐藥性的產生與細菌自身特性﹑耐藥基因的傳播和藥物的使用情況等諸多因素有關[13]。因此，畜禽養殖場發生細菌性疾病時，準確快速鑒定致病菌，進行藥物敏感試驗，選擇敏感藥物進行治療至關重要。同時，平時飼養管理中，規范臨床抗生素使用，矯正抗生素的不規范使用，不同敏感抗生素之間交替使用，可有效減少多重耐藥菌株的出現。