兔源大腸桿菌的分離鑒定

王新新，任 曼，孫 浩

（1.塔里木大學動物科學與技術學院 843300；2.新疆阿克蘇地區民政局 843000）

大腸埃希氏細菌隸屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae）﹑埃希氏菌屬（Escherichia）﹑大腸桿菌種（coli），是革蘭氏陰性的直桿菌，無芽孢[1-3]，兼性厭氧，常存在于人和動物的腸道。致病性大腸桿菌常引起幼齡動物嚴重腹瀉和敗血癥[4-6]。兔大腸桿菌病（rabbits colibacillosis）又名黏液性腸炎，以幼齡兔發生流涎﹑腹瀉﹑排鼠糞樣或透明膠胨樣糞為主要特征[7]，在兔養殖業中常見并危害較大的一種疾病。本試驗對某兔場的疑似病例開展病原分離鑒定，并對其進行動物試驗，從而對兔源大腸埃希氏菌的分離鑒定和兔大腸桿菌病的實驗室診斷提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

病料來自新疆阿拉爾市某兔場。采集腹瀉癥狀的兔子糞樣﹑病死兔的腸內容物和肝臟。樣品均無菌采集，并裝入無菌處理的密封袋和凍存管，單獨標記，置于-20℃冰箱保存備用。

1.1.2 主要試劑

普通瓊脂（LB）固體培養基﹑麥康凱培養基﹑伊紅美藍培養基﹑SS瓊脂培養基﹑葡萄糖發酵管﹑甘露醇發酵管﹑麥芽糖發酵管﹑蔗糖發酵管﹑乳糖發酵管﹑衛矛醇發酵管等均購自杭州天和微生物試劑有限公司；革蘭氏染色試劑盒鑒定套裝，購自北京陸橋技術有限責任公司。

1.1.3 儀器設備

GEX-9272MBE型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠產品；LDZX-40Bl型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠產品；電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司產品；超凈工作臺，上海博迅實業有限公司醫療設備廠產品；HPX-9272MBE數顯不銹鋼電熱培養箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 分離純化及生長特性鑒定

按照無菌操作方法取兔小腸內容物和糞便樣品，用生理鹽水稀釋后用移液槍滴加到麥康凱培養基上并用涂布棒進行涂布均勻（分別標號為腸內容物﹑1號糞便﹑2號糞便），在肝組織切面上用涂布棒蘸取肝切面后移于麥康凱培養基上涂布均勻（標號為肝組織）,置37℃溫箱中培養24h，觀察菌落形態。

按照無菌操作方法從麥康凱瓊脂平板上挑取單個紅色菌落[14]，接種于伊紅美藍瓊脂平板﹑SS瓊脂平板﹑普通瓊脂固體培養基上，于37℃溫箱中培養24h。

生長特性的鑒定依據：大腸桿菌在普通瓊脂培養基上生長成光滑﹑白色或灰白色菌落；在伊紅美藍瓊脂培養基上生長成黑色帶有金屬光澤的菌落；在麥康凱培養基上生長成紅色或粉紅色菌落；在SS瓊脂平板上生長不良或不生長[3]。

1.2.2 染色鏡檢

按照革蘭氏染色試劑盒鑒定套裝說明書進行染色，鏡檢。

判定標準：經革蘭氏染色的大腸桿菌在光學顯微鏡下呈紅色﹑兩端鈍圓﹑短桿狀[3]。

1.2.3 生化試驗

1.2.3.1 糖發酵試驗

選取葡萄糖﹑乳糖﹑衛矛醇﹑蔗糖﹑甘露醇﹑麥芽糖六種糖分別在微量反應管中進行糖發酵試驗。使用微量反應管時，輕輕用鉗子夾斷以上無培養基的玻璃管，然后用在酒精燈灼燒的接種針蘸取相對應的已經培養好的純菌種接種，放在37℃恒溫箱過夜培養，18～24 h觀察并記錄觀察結果。

1.2.3.2 硫化氫試驗

蘸取被檢細菌的純培養物，接種于硫化氫微量反應管中，放在37℃恒溫培養箱中培養1～2 d后觀察結果。

1.2.3.3 觸酶試驗

用酒精燈灼燒的接種環將被檢菌落放于載玻片1/3處，滴加一滴3%雙氧水于菌落上，立即觀察是否有氣泡產生。

1.2.3.4 枸櫞酸鹽利用試驗

將從兔腸段上取得的被檢菌接種于枸櫞酸鹽培養基，于35℃恒溫培養1～4 d，每日觀察記錄。

1.2.4 動物試驗

取1號糞便﹑2號糞便﹑腸內容物中分離鑒定的大腸桿菌，分別注射5只昆明小鼠。1號糞便中分離鑒定的大腸桿菌分別注射5只昆明小鼠（注射劑量均為0.5mL）。注射后連續觀察48h并記錄結果。

2 結果

2.1 分離培養結果

通過分離培養，分別從標號1號糞便﹑2號糞便和腸內容物的培養基上得到三株疑似菌（分別標記為1F﹑2F﹑C）。1F﹑2F上得到的疑似菌在普通瓊脂培養基上生長良好，形成光滑﹑灰白色菌落（圖1），在麥康凱培養基形成紅色圓形菌落（圖2），在伊紅美蘭瓊脂平板上長出黑紫色帶金屬光澤的圓形菌落（圖3），SS瓊脂培養基未形成肉眼可見的菌落。

圖1 2F LB培養基

圖2 2F 麥康凱培養基

圖3 1F 伊紅美藍培養基

2.2 生化試驗結果

見表1及圖4～9。

表1 生化試驗結果

圖4 1F

圖5 2F

圖6 1F

圖7 2F

圖8 C

圖9 硫化氫試驗

2.3 動物試驗結果

注射2號糞便和腸內容物中分離的菌株，5只昆明小鼠在12 h內死亡3只；解剖觀察后發現，腹腔有少量積液，肝臟邊緣變黑，其它實質臟器眼觀無明顯病理變化。注射1號糞便中分離的菌株，5只昆明小鼠均未發現引起死亡。

3 討論

本試驗采集新疆阿拉爾市某兔場疑似大腸桿菌病例的病料，對其進行了細菌培養，形態學觀察（革蘭染色鏡檢），生化試驗及試驗動物感染試驗。病料通過預處理后，分別接種到普通瓊脂培養基﹑麥康凱培養基﹑伊紅美藍培養基﹑SS瓊脂培養基。經過培養后，標記為1號糞便﹑2號糞便和腸內容物的培養基中均培養出類似大腸桿菌的菌落，生長特性均符合要求。分別挑取單個菌落，涂片，革蘭氏染色鏡檢。結果發現，均為革蘭氏陰性（紅色）﹑兩端鈍圓﹑成雙或散裝排列的短桿菌，形態特征符合預期要求。

通過形態學觀察的單個菌落進行純化增菌后，對其開展了生化試驗，從生化試驗結果來看，腸內容物糖發酵試驗結果與其他兩組試驗結果有較大區別，1號糞便與2號糞便糖發酵試驗結果中葡萄糖﹑衛矛醇﹑乳糖都是產酸產氣，而腸內容物試驗結果只有葡萄糖產酸產氣，衛矛醇既不產酸也不產氣其他兩個不產氣，乳糖只產酸不產氣，蔗糖試驗結果只有1號糞便產酸產氣其他兩組不產酸產氣，麥芽糖和甘露醇三組都是只產酸不產氣。枸櫞酸鹽利用試驗三組都無顏色變化。硫化氫試驗中三組都無顏色變化。各種生化特性均符合于大腸肝菌，從而確定此3株細菌為大腸桿菌。

再進一步對昆明小鼠進行感染試驗發現，2號糞便和腸內容物中分離的菌株具有致死性，而1號糞便分離的菌株未引起試驗動物死亡。從而確定，2號糞便和腸內容物中分離出的菌株具有致病特性。

4 結論

本試驗采集疑似大腸桿菌病的兔子病料，對其開展細菌分離培養，染色鏡檢和生化試驗。最終，從中分離出3株疑似菌。經過生長特性﹑形態學觀察和生化特性鑒定后，確定其為大腸桿菌。通過感染試驗發現，其中2種菌株具有致病特性。