低溫大氣壓等離子體對脫礦牙本質膠原保護作用的體外研究

贠 寧，王丹楊*，丁 鵬，謝 娜，吳昊宸，李 璇，朱曼琪

（1.西安醫學院 口腔醫學院 口腔修復學教研室，西安 710021；2.西安醫學院 口腔醫學院 口腔內科學教研室，西安 710021；3.西安醫學院校醫院（未央區未央湖醫學院社區衛生服務中心），西安 710021）

牙本質是一種結構特殊且成分復雜的牙體硬組織，由具有三維框架結構的牙本質小管和管周、管間牙本質組成，其主要成分為70%無機物、20%有機物和10%水[1]。有機物中約90%為I型膠原蛋白，10%為非膠原蛋白[1]。當牙本質遇到酸性物質引起礦物質大量丟失之后，就會導致膠原纖維網暴露，脫礦的膠原纖維十分敏感，會在細菌代謝產物和基質金屬蛋白酶的攻擊下發生水解，引發齲病，降低牙本質粘接修復的持久性[2]。

低溫常壓等離子體（Non-Thermal Atmospheric Pressure Plasma，NTAPP）是近年來一種新興的表面處理技術，可以產生大量帶電粒子、各種離子、自由基和活性氧等活性物質，并且在能量轉換時對周圍環境的加熱作用較弱，因此可保持較低溫度，使得等離子體技術可以應用于敏感性較高的生物組織[3]。已有研究證實，等離子體處理可誘導明膠在液態和固態時發生交聯，還能夠增加膠原纖維表面含氧官能團[4]，有利于保存牙本質膠原纖維的三維形貌。但NTAPP是否是通過增加膠原交聯度的方式增韌膠原，尚需研究進一步證實。

本研究擬探討NTAPP處理脫礦牙本質后，對膠原纖維的交聯度及膠原耐降解性的影響，以期為NTAPP在牙酸蝕癥、齲病的治療和牙本質粘接領域的應用奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 主要儀器

場發射掃描電鏡（JSM-7500F，Jeol，日本）、低速金剛石切割機（沈陽科晶自動化設備制造有限公司）、低溫常壓等離子體發生裝置（CTP-2000K，南京蘇曼等離子科技有限公司）、示波器（MSO1104Z，蘇州普源精電科技有限公司）、冷凍離心機（5804 R，Eppendorf，德國）、全自動樣品快速研磨儀（Tissuelyser-48，上海凈信科技）、電子天平（Sartorius，德國）、冷凍干燥機（ES2030，Hitachi，日本）及酶標儀（Thermo Multiskan－GO，美國）。

1.2 主要試劑和材料

茚三酮試劑（鼎國生物試劑有限公司，北京）、磷酸（國藥集團，北京，中國）、37%磷酸酸蝕劑（Vericom公司，韓國）、高純度氦氣（99.999%，西安天盛氣體有限公司）及去離子水。

收集新鮮無齲的第三磨牙（西安醫學院第二附屬醫院口腔科），患者知情同意，刮除附著軟組織，清洗后生理鹽水中4℃保存，于1周內使用。本研究由西安醫學院倫理委員會審查通過，批準號為XYLS2020142，患者均簽署知情同意書。

1.3 膠原交聯度測試

1.3.1 NTAPP射流產生

本研究使用的NTAPP設備采用連續正弦波驅動的介質阻擋放電原理，電源輸入功率為8 W，峰值電壓Vpp為7.0 kV，頻率為54.9 kHz，放電氣體為高純度氦氣（He），氣體流量為3 L/min。

1.3.2 牙本質粉制備

15顆新鮮離體牙用慢速切割機在流水降溫條件下，截取冠部牙本質，體式顯微鏡檢查無釉質殘留，片切成1 mm厚的牙本質片，液氮中凍存30 min，隨后用全自動樣品快速研磨儀將牙本質片磨成牙粉（60 Hz，90 s），研磨罐內加有液氮以保持試件在低溫下粉碎。牙粉過篩后，選取直徑小于20μm的牙粉，用10%的磷酸溶液4℃下浸泡24 h至完全脫礦，無菌去離子水反復沖洗離心牙本質粉5次（3000 rpm/2 min，4℃），最后一次沖洗離心后棄掉上清液（14000rpm/10min，4℃），冷凍干燥備用。實驗分為空白對照組、陽性對照組和實驗組。空白對照組的牙粉不做任何處理；陽性對照組稱取10 mg全脫礦牙粉，用4 mL 5%的戊二醛浸泡120 s，清洗、離心及凍干備用；實驗組牙粉置于微孔板中并滴加50μL無菌去離子水混合均勻，NTAPP在8 W 3L條件下處理15 s（2.5 mg/次，n=4次），具體操作步驟如前所述[5]，同樣清洗、離心、凍干備用。

1.3.3 交聯度測試

每組稱量2.5 mg處理后的牙粉做茚三酮染色實驗，各組分別加入1 mL無菌去離子水，靜置60 min后加入3mL茚三酮試劑（2%茚三酮-無水乙醇溶液），100℃水浴加熱20 min，冷卻至室溫后加入5 mL 60%乙醇溶液，在570 nm波長下用酶標儀測量吸光度，每組設3個平行樣本（200μL/樣），以平均值作為該組該次樣本的測量值。以梯度濃度的甘氨酸溶液繪制標準曲線，依據各組吸光度，對比標準曲線計算自由α-氨基酸的含量。根據公式計算各組交聯度[5]。

式中：M0和Mt分別表示交聯處理前后牙本質膠原中自由α-氨基酸的量。

1.4 牙本質膠原耐次氯酸鈉溶解作用的檢測

1.4.1 試件制備

流水沖洗下，11顆新鮮離體牙用慢速切割機去除咬合面釉質層，截取冠部牙本質，每顆牙可制取3片1.5 mm×1.5 mm×6 mm大小的牙本質片，每個牙片背面刻2道刻痕以區分試件正反面。32個試件隨機分為陰性對照組和實驗組（n=16片）。牙本質表面用37%的磷酸凝膠酸蝕15 s，流水沖洗60 s，對照組試件置于去離子水中備用。無塵紙巾吸干實驗組試件表面水分后，置于NTAPP噴嘴下方3 cm處，使射流均勻噴刷牙面15 s。隨后各組牙本質片分別浸泡于3.5 mL 5%的NaClO溶液中0、30、60、120 s（n=4片），然后流水下沖洗4 h。

1.4.2 膠原顯微形貌觀察

將處理后的牙本質試件，用2.5%戊二醛0.1 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液（PBS）固定4 h，PBS沖洗3次，乙醇梯度脫水，真空干燥、噴金，在場發射掃描電鏡（FE-SEM）下觀察脫礦牙本質膠原的超微結構。

1.5 數據處理及統計分析

采用SPSS 18.0統計軟件，數據符合正態分布，對膠原的交聯度進行獨立樣本t檢驗，檢驗水準為0.001。

2 結果

2.1 交聯度

各處理組的交聯度如圖1所示，5%戊二醛處理120 s的交聯度為68.17%，NTAPP處理15 s組的交聯度稍低于戊二醛組，為65.92%，但2組間無顯著性差異（P＞0.001）。

圖1 各處理組脫礦膠原交聯度（X±s，n=4）

2.2 次氯酸鈉溶解后各組膠原纖維形貌

由圖2可見，隨著NaClO處理時間延長，各組膠原纖維網均出現不同程度降解現象。對照組未經NaClO處理前，牙本質小管間、管周及小管內膠原纖維網完整，如圖2（a）所示。經NaClO處理30s后，小管間膠原纖維間隙消失，管內膠原出現斷裂現象，部分管周膠原纖維降解，如圖2（b）所示。經NaClO處理60s后，膠原纖維降解現象加劇，僅某些小管內可見單根完整的膠原纖維，如圖2（c）所示。經NaClO處理120s后，膠原纖維完全降解，牙本質小管口開放呈較大的漏斗狀，根管壁可見側支開口，如圖2（d）所示。

NTAPP處理15 s組未經NaClO處理（如圖2（e）所示）和經NaClO處理30s（如圖2（f）所示），膠原纖維網形貌與對照組未經NaClO處理相似，無明顯改變。經Na－ClO處理60s后，管間和部分管周膠原纖維網降解，小管內和部分管周膠原纖維網結構仍較完整，如圖2（g）所示。經NaClO處理120s后，膠原纖維進一步降解，未降解的膠原纖維出現斷裂和卷曲現象，如圖2（h）所示。

圖2 NaClO處理不同時間各組膠原纖維FE-SEM圖像

3 討論

本研究證實經過NTAPP處理后，可以增加牙本質膠原的交聯度，提高牙本質膠原的耐降解性，其效果與戊二醛處理結果相當。

經NTAPP處理后的具體機制可能與等離子體射流產生的紫外線相關，有研究表明，紫外線輻射可以使明膠鏈發生交聯作用[6]：有學者研究發現紫外線能夠打破膠原蛋白的弱內在交聯，并產生自由基，其結合光敏劑產生的活性氧可誘導分子間共價鍵形成分子間交聯[7]。

本研究評價了NTAPP處理對提高脫礦牙本質膠原交聯度及脫礦牙本質膠原纖維耐NaClO溶液降解的能力。眾所周知，戊二醛是一種用于制備植入性生物材料的膠原固定劑，本研究使用NTAPP處理脫礦牙本質膠原后，其交聯度與戊二醛處理結果相當，提示NTAPP具有較好的促交聯作用。NaClO對蛋白質具有非特異性降解作用[8]。由圖1可知，經NTAPP處理后，膠原的降解程度減緩，提示NTAPP處理可改善牙本質膠原纖維的強度。等離子體能夠產生多種活性物質，其中的紫外線可引起明膠分子間交聯，并在膠原和明膠氨基酸（如酪氨酸和苯丙氨酸）的芳香殘基上形成自由基[6，9]。其次，等離子體產生的自由基可與OH相互作用，在聚合纖維上形成羥基化合物，隨后可通過氫鍵增加交聯數量[10]。此外，等離子體中的電子也與基質相互作用，在聚合物鏈中形成自由基，引發聚合鏈中瞬間形成自由基，進而啟動交聯過程[4]。本研究結果正是通過NTAPP增加膠原交聯度的作用，提升了膠原的耐降解性。

4 結論

在適宜的條件下，NTAPP處理可有效增加脫礦牙本質膠原的交聯度，增強脫礦膠原纖維耐NaClO溶解的能力。本研究中，最適宜的處理時間是15 s。該研究結果為NTAPP在牙酸蝕癥、齲病的治療和牙本質粘接領域的應用提供了新的思路。