胎兒頸項透明層厚度超聲檢測聯合母體外周血單核細胞RIPK1、miR-22-3p在胎兒先天性心臟病篩查中的價值

孫洪洋 劉文波 姜陽 王婷 張穎 楊欣

隨著近年來國內外相關研究的日益深入，不少學者發現孕早期胎兒頸項透明層（NT）厚度可能和先天性心臟?。–HD）存在密切相關，其中NT 厚度作為早期篩查CHD 的重要指標已在國內得到應用和普及[1-3]。此外，程序性壞死屬于調節性細胞死亡方式之一，其中受體相互作用蛋白激酶1（RIPK1）屬于程序性壞死關鍵性因子，其中RIPK1-RIPK3-MLKL 通路的異常激活會促進程序性壞死的發生，而程序性壞死在多種心臟疾病的發生、發展中均發揮著關鍵性作用，由此推測RIPK1 可能具有一定的預測胎兒CHD 價值[4]。microRNA 是近年來所發現一類新型非編碼單鏈RNA，且在心血管疾病的發生、發展過程中扮演著重要的角色，可能參與了心臟發育、心臟形態變化及心肌細胞生長、分化的調控過程[5]。鑒于此，本文通過研究胎兒NT厚度超聲檢測聯合母體外周血單核細胞（PBMCs）RIPK1、miR-22-3p 表達篩查胎兒CHD 的價值，以期為臨床胎兒CHD 的防治工作開展提供指導依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2019 年2 月-2021 年2 月于佳木斯市中心醫院接受規律性產檢，且隨訪明確胎兒伴有CHD 的41 例孕婦為研究組，另取同期于醫院接受規律性產檢，且隨訪明確胎兒無CHD的41 例孕婦作為對照組。納入標準：（1）所有胎兒均經超聲檢查確診[6]；（2）孕婦年齡20～40 歲；（3）無臨床病歷資料缺失。排除標準：（1）神志異?；蚝喜⒕窦膊?；（2）未遵循規定時間體檢或檢查/診斷依從性較差；（3）伴有其他部位畸形；（4）合并肝、腎等臟器嚴重障礙。本研究獲準于醫院醫學倫理委員會。

1.2 方法（1）NT 厚度檢測：檢測時間為孕早期，協助孕婦取仰臥位，保證腹部完全暴露，之后由醫院影像科醫師采用GE-E8 超聲診斷儀（探頭頻率為3.5～5.0 MHz）于二維模式下開展超聲檢測。選取胎兒面部正中矢狀切面，胎兒呈自然俯屈位，完成頭臂長的測量。之后放大圖像促使超聲聲束和胎兒體表呈垂直角度，顯示胎兒頭部和上胸部，暴露胎兒丘腦及菱腦，清晰顯示胎兒背部皮膚，于頸部皮膚高回聲帶的深部顯示無回聲或低回聲帶記作NT。測量過程中務必連續測量3 次，以厚度最大值作為最終結果。（2）PBMCs RIPK1、miR-22-3p 表達檢測：分別采集所有孕婦孕早期空腹靜脈血3 mL，離心處理后分離血漿，并滴加淋巴細胞分離液（購自達科為生物技術股份有限公司），以梯度離心法采集PBMCs，隨后加入TRIzol 試劑（購自美國Invitrogen）充分裂解，保存至-80 ℃冰箱中備用。通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）獲取PBMCs 的總RNA。之后采用逆轉錄試劑盒（購自瑞士羅氏公司）合成獲取cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，通過cobas z480 全自動熒光定量PCR 分析儀（購自瑞士羅氏公司）檢測RIPK1、miR-22-3p mRNA 相對表達量。擴增條件如下：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。溶解反應條件如下：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。以2-△△Ct法計算相對表達水平。

1.3 觀察指標及判定標準 比較兩組NT 厚度及PBMCs RIPK1、miR-22-3p 表達水平，且以隨訪結局作為金標準，分析NT 厚度及PBMCs RIPK1、miR-22-3p 表達水平對胎兒CHD 的診斷效能。NT厚度＞2.5 即判定為CHD；PBMCs RIPK1＞1.30 即判定為CHD；miR-22-3p＜1 即判定為CHD。三項聯合檢測即任意一項陽性即為CHD，三項均為陰性即為非CHD。敏感度=真陽性例數/（真陽性+假陰性）例數×100%；特異度=真陰性例數/（真陰性+假陽性）例數×100%；準確度=（真陽性+真陰性）例數/總例數×100%。

1.4 統計學處理 數據處理方式由SPSS 22.0 軟件完成，計量資料采用（±s）表示，比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料用率（%）表示，比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 研究組年齡20～40歲，平均（28.31±1.39）歲；孕周11～14 周，平均（12.31±0.35）周；受教育年限9～16 年，平均（12.31±1.36）年。對照組年齡20～40 歲，平均（28.40±1.45）歲；孕 周11～14 周，平 均（12.35±0.37）周；受教育年限9～16年，平均（12.36±1.37）年。兩組一般資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 兩組NT 厚度及母體PBMCs RIPK1、miR-22-3p 表達水平對比 研究組NT 厚度和PBMCs RIPK1水平均高于對照組，而PBMCs miR-22-3p 水平低于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 兩組NT厚度及PBMCs RIPK1、miR-22-3p表達水平比較（±s）

表1 兩組NT厚度及PBMCs RIPK1、miR-22-3p表達水平比較（±s）

2.3 NT厚度及PBMCs RIPK1、miR-22-3p 表達水平對胎兒CHD 的診斷情況對比 以隨訪結局作為金標準，NT 厚度及PBMCs RIPK1、miR-22-3p表達水平聯合診斷胎兒CHD 的敏感度、特異度及準確度均高于NT 厚度、PBMCs RIPK1 及PBMCs miR-22-3p 單獨診斷（P＜0.05），見表2、3。

表2 NT厚度及PBMCs RIPK1、miR-22-3p表達水平對胎兒CHD的診斷情況對比（例）

表3 NT厚度及PBMCs RIPK1、miR-22-3p表達水平診斷胎兒CHD的效能對比（%）

3 討論

針對CHD 胎兒進行早期有效的診斷和治療具有極其重要的意義[7-9]。國內外不少研究表明，孕14 周之前的胎兒淋巴組織和系統尚未發育成熟，從而導致部分淋巴液積聚于頸部淋巴管及淋巴囊內，進一步形成NT，且在孕14 周后，伴隨著胎兒各組織系統的不斷發育成熟，特別是伴隨著淋巴細胞的逐漸成熟，NT 會快速消失[10-12]。故此，針對早期CHD 的篩查可借助NT 的特點開展診斷鑒定。

本研究發現，研究組NT 厚度及PBMCs RIPK1水平均高于對照組，而PBMCs miR-22-3p 水平低于對照組（P＜0.05）。這反映了CHD 患兒NT 厚度明顯增加，且孕婦孕早期PBMCs RIPK1 水平異常升高，PBMCs miR-22-3p 水平異常降低。原因在于CHD 屬于胸部內部結構異常，可能會引起淋巴管和頸靜脈淋巴液回流受阻，進一步導致淋巴液大量積聚于頸項部，最終表現為NT 厚度的增加[13-15]。RIPK1 屬于絲/蘇氨酸激酶，在觸發程序性壞死時，RIPK1 會在其絲氨酸/蘇氨酸殘基位點出現自身磷酸化，且可通過和RIPK3 相結合，進一步導致RIPK3 出現自身磷酸化，從而大量募集混合譜系激酶結構域樣假激酶（MLKL），而活化的MLKL 可通過不同途徑參與細胞壞死的發生，最終引發CHD的發生、發展。人心肌轉錄因子4（GATA4）是人心肌轉錄因子（GATA）家族重要成員之一，可能參與了心肌受損后的修復及重建。故此，GATA4正常水平的表達在維持心臟正常生理功能過程中起著至關重要的作用。而miR-22-3p 可通過調控GATA4 基因的表達，進一步改變CHD 遺傳易感性，促進了CHD 的發生、發展[16-18]。此外，以隨訪結局作為金標準，NT 厚度及PBMCs RIPK1、miR-22-3p表達水平聯合診斷胎兒CHD 的敏感度、特異度及準確度均高于NT 厚度單獨診斷、PBMCs RIPK1 單獨診斷及PBMCs miR-22-3p 單獨診斷。這反映了孕早期檢測NT 厚度及母體PBMCs RIPK1、miR-22-3p表達水平聯合診斷胎兒CHD 的效能較佳。究其原因，聯合檢測時可為醫生診斷CHD 提供較為全面的依據，進一步達到提高臨床診斷效能的目的。然而，佟紅梅[19]的研究發現，NT 厚度以＞2.4 mm 為臨界值，診斷CHD 的敏感度、特異度及準確度分別為90.00%、87.50%、88.75%，這明顯高于本研究結果，而導致上述差異發生的主要原因可能和入選對象接受NT 厚度超聲檢查的孕周不同有關。且相較于上述研究而言，本文還分析了母體PBMCs RIPK1、miR-22-3p 表達水平對胎兒CHD 的診斷價值，亦是本研究的創新之處。

綜上所述，孕早期聯合檢測NT 厚度及母體PBMCs RIPK1、miR-22-3p 表達水平，可在一定程度上提高胎兒CHD 的診斷敏感度、特異度及準確度。