生物樣本中短鏈脂肪酸含量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)教學(xué)改進(jìn)研究

＊康安 鄧海山

（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 江蘇 210000）

引言

前期，在我校儀器分析實(shí)驗(yàn)中，采用氣相色譜程序升溫測(cè)定了水溶液中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸的含量，重點(diǎn)考察學(xué)生對(duì)于氣相色譜法中“程序升溫”這一知識(shí)點(diǎn)的掌握，尤其是側(cè)重讓學(xué)生理解影響氣相色譜分離的主要影響因素[1-3]。但該實(shí)驗(yàn)存在以下不足：（1）與氣相色譜中驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)有較多重復(fù)，在實(shí)驗(yàn)中我們僅考察程序升溫對(duì)各化合物保留時(shí)間、峰形的影響，設(shè)計(jì)性略顯不足；（2）未針對(duì)實(shí)際的生物樣本進(jìn)行分析；（3）實(shí)驗(yàn)的綜合性及可拓展性方面仍有改進(jìn)空間；（4）學(xué)校儀器分析課程中缺少高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)儀器分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)特點(diǎn)，結(jié)合學(xué)校對(duì)于創(chuàng)新型人才培養(yǎng)的要求，設(shè)計(jì)出一個(gè)兼具綜合性、設(shè)計(jì)性和開放性的實(shí)驗(yàn)，從而有效提高我校相關(guān)專業(yè)學(xué)生的專業(yè)技能。據(jù)此我們結(jié)合指導(dǎo)老師的科研項(xiàng)目，對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了改進(jìn)。具體的改進(jìn)思路為：（1）研究對(duì)象明確為生物樣本中的短鏈脂肪酸；（2）利用化學(xué)衍生化法獲得短鏈脂肪酸的衍生化產(chǎn)物[4]；（3）采用液相色譜-質(zhì)譜對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，提高檢測(cè)靈敏度，進(jìn)一步加深學(xué)生對(duì)質(zhì)譜法相關(guān)理論知識(shí)的理解；（4）加入開放性實(shí)驗(yàn)元素，例如，如何改進(jìn)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性（衍生化過程，同位素衍生化試劑，色譜條件的優(yōu)化，質(zhì)譜條件的優(yōu)化，方法的應(yīng)用）。最終將改進(jìn)后的綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)教學(xué)課時(shí)從6學(xué)時(shí)調(diào)整為8學(xué)時(shí)。

1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的理論依據(jù)

短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸，戊酸）為極性化合物，沸點(diǎn)低，無強(qiáng)紫外-可見光吸收。儀器分析檢測(cè)中，多采用程序升溫氣相色譜對(duì)其同時(shí)進(jìn)行定量分析。采用氣相色譜法分析時(shí)，以4-甲基戊酸為內(nèi)標(biāo)，對(duì)樣品先后進(jìn)行磷酸酸化后，再采用乙酸乙酯萃取后進(jìn)樣分析。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)水溶液中的短鏈脂肪酸進(jìn)行定量分析。

改進(jìn)后的方法原理如下：

首先采用3-硝基苯肼為衍生化試劑，在縮合劑EDC[即1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺]和堿性物質(zhì)吡啶存在的條件下，與短鏈脂肪酸發(fā)生縮合生成中間物活化羧基，氧原子具有強(qiáng)吸電子性導(dǎo)致羧基碳原子缺電子，此時(shí)3-硝基苯肼端基氮原子作為親核試劑進(jìn)攻中間產(chǎn)物中羧基碳原子，使C-O單鍵斷裂，形成酰胺鍵[4]，生成酰胺類化合物（圖1）。

圖1 短鏈脂肪酸與衍生化試劑3-硝基苯肼的衍生化過程

生成的衍生化產(chǎn)物在電噴霧離子源中，在負(fù)離子模式下，形成相應(yīng)的[M-H]-峰，進(jìn)一步碎裂，產(chǎn)生137的碎片離子。典型衍生化產(chǎn)物的碎裂規(guī)律如圖2所示。進(jìn)一步通過優(yōu)化DP（De-clustering Potential）電壓，碰撞能量等參數(shù)，優(yōu)化得到檢測(cè)這些衍生化產(chǎn)物的質(zhì)譜條件。圖2為乙酸和丁酸在負(fù)離子模式下的產(chǎn)物離子圖。

圖2 乙酸（a）及丁酸（b）衍生化產(chǎn)物的產(chǎn)物離子掃描圖

衍生化后，各衍生化產(chǎn)物較其本身的極性大大減小，可在反相高效液相色譜系統(tǒng)中，得到保留。但在這五種短鏈脂肪酸中，丁酸和異丁酸為同分異構(gòu)體；而在實(shí)際樣本中，戊酸可能會(huì)受到其同分異構(gòu)體如2-甲基丁酸，3-甲基丁酸的影響。學(xué)生需要通過優(yōu)化色譜條件，分離各同分異構(gòu)體。

整個(gè)實(shí)驗(yàn)的流程圖如圖3所示，其中綜合性、設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括了樣品的前處理、衍生化條件的優(yōu)化、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的分析和數(shù)據(jù)處理及分析這四個(gè)內(nèi)容。在教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心儀器空閑時(shí)，還可以加入一些開放性實(shí)驗(yàn)的元素，來增加實(shí)驗(yàn)的探索性和涉及知識(shí)的深度。

圖3 實(shí)驗(yàn)流程圖

2.實(shí)驗(yàn)實(shí)施步驟

(1)實(shí)驗(yàn)步驟

①樣品前處理。取糞便樣本50mg，加入19倍體積的50%乙腈溶液，加鋼珠進(jìn)行研磨。12000rpm離心10min，取上清進(jìn)行衍生化。在衍生化條件優(yōu)化中，將短鏈脂肪酸對(duì)照品各自配制成濃度約1mg/mL的溶液，經(jīng)稀釋、混勻，選擇合適的濃度用于后續(xù)的衍生化條件優(yōu)化。

②衍生化條件的優(yōu)化。首先配制濃度為200mM的3-硝基苯肼鹽酸鹽溶液：稱取379mg的3-硝基苯肼鹽酸鹽，加入50%乙腈溶液，振蕩混勻后，避光待用。按照類似的方法配制濃度為120mM的EDC和6%的吡啶溶液。具體的衍生化條件為：吸取對(duì)照品溶液80μL，40μL的3-硝基苯肼鹽酸鹽溶液，40μL的EDC鹽酸鹽溶液，渦旋振蕩30s后，在不同溫度下，反應(yīng)不同時(shí)間后，放冷，經(jīng)離心后取一定量的上清，稀釋10倍，進(jìn)樣分析。

③標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備和樣品的衍生化。吸取經(jīng)均質(zhì)化處理后的樣品上清液80μL，加入10μL的濃度為5μg/mL的內(nèi)標(biāo)，分別加入40μL的3-硝基苯肼鹽酸鹽溶液和EDC鹽酸鹽溶液，渦旋振蕩30s后，在40℃下，反應(yīng)30min，放冷，經(jīng)高速離心，取20μL的上清，加入180μL的50%乙腈稀釋后，進(jìn)樣分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線采用含上述5種短鏈脂肪酸混合溶液各80μL，加入10μL的濃度為5μg/mL的氘代己酸，后續(xù)處理同生物樣品。

④液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的條件。色譜條件：色譜柱：Hypersil Gold（100mm×2.1mm，3μm）；柱溫：45℃；流動(dòng)相：水相（A）：0.1%甲酸水，有機(jī)相（B）：乙腈；進(jìn)樣量3μL；流速：0.4mL/min；梯度洗脫：0～1min，10% B；1～11min，10%→35% B；11～14 min，35%→90% B；14～15min，90% B；15～16min，10% B；16～18min，10% B。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），離子源溫度（TEM）550℃，氣簾氣（CUR）30psi，霧化氣（GS1）55psi，輔助加熱氣（GS2）55psi，離子源噴霧電壓（IS）-4500V。待測(cè)物的監(jiān)測(cè)離子對(duì)信息如下：乙酸:194.1→137.1、丙酸：208.1→165.1、丁酸和異丁酸：222.1→137.1、V戊酸：236.1→137.1。

⑤結(jié)果處理。采用儀器自帶的分析軟件，對(duì)各提取離子流的色譜峰進(jìn)行積分，以氘代己酸為內(nèi)標(biāo)，分別以各化合物的Ai/As為縱坐標(biāo)，各化合物的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行線性回歸，得擬合方程，將樣品的Ax/As帶入回歸方程，計(jì)算其濃度。

(2)開放性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路

①如何更加準(zhǔn)確的定量分析。衍生化過程還有哪些可以優(yōu)化的條件？?jī)?nèi)標(biāo)物選擇是否合理，能否采用同位素衍生化試劑[4]？如果采用同位素衍生化試劑實(shí)驗(yàn)可以如何改進(jìn)？

②如何提高液相色譜的分離和質(zhì)譜的響應(yīng)信號(hào)。丁酸和異丁酸為同分異構(gòu)體；戊酸，2-甲基丁酸和3-甲基丁酸為同分異構(gòu)體，如何通過改變色譜條件，進(jìn)行更有效的分離分析？質(zhì)譜條件優(yōu)化時(shí)，主要包括哪些參數(shù)？

③能不能拓寬該方法的應(yīng)用范圍。含酮基、醛基的化合物能否采用此衍生化條件？氨基酸類化合物、短肽類化合物能否檢測(cè)？中、長(zhǎng)鏈的脂肪酸是否也可以用該方法檢測(cè)？

3.實(shí)驗(yàn)教學(xué)展示

(1)衍生化產(chǎn)物在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜中的MRM色譜圖

我們將混合短鏈脂肪酸的對(duì)照品溶液經(jīng)衍生化后，在前述實(shí)驗(yàn)條件下，進(jìn)樣分析，得到MRM色譜圖。在該色譜條件下，各化合物得到比較好的分離。乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸和戊酸的保留時(shí)間分別為4.21min、6.12min、7.88min、8.21min和10.25min。

(2)衍生化條件的優(yōu)化

我們主要優(yōu)化的參數(shù)為乙腈濃度，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間。而通常加入的3-硝基苯肼鹽酸鹽是過量的，無需對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。為保證在規(guī)定課時(shí)下完成教學(xué)工作，我們減少了實(shí)驗(yàn)需優(yōu)化的因素，在實(shí)驗(yàn)中我們告知了學(xué)生衍生化條件中的EDC和吡啶的最佳濃度。因此本實(shí)驗(yàn)，只采用單因素考察乙腈濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)所得衍生化產(chǎn)物在質(zhì)譜中的響應(yīng)信號(hào)的影響。

根據(jù)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)選擇50%乙腈時(shí)，產(chǎn)物的質(zhì)譜信號(hào)較強(qiáng)；在40℃時(shí)，各化合物的響應(yīng)較高，溫度升高，反而不利于衍生化產(chǎn)物的生成；反應(yīng)時(shí)間為30min及30min以上各衍生化產(chǎn)物的信號(hào)一直較穩(wěn)定。據(jù)此，我們得到最終的衍生化條件。

(3)生物樣本中短鏈脂肪酸的濃度

學(xué)生將小鼠糞便樣本進(jìn)行衍生化后，采用前述液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，得到各化合物的提取離子流色譜圖，在實(shí)際的生物樣本中，各化合物也得到較好的分離，可用于后續(xù)的定量分析。

將制備好的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品進(jìn)樣分析后，數(shù)據(jù)經(jīng)線性擬合，得回歸方程。學(xué)生還檢測(cè)了小鼠糞便樣本中五種短鏈脂肪酸的濃度。將各短鏈脂肪酸的峰面積與內(nèi)標(biāo)的比值，帶入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到基質(zhì)中乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸和戊酸的濃度分別為382.1ng/mL、171.5ng/mL、89.2ng/mL、25.6ng/mL、42.5ng/mL。

4.結(jié)語

我們將前期實(shí)驗(yàn)改為“采用化學(xué)衍生化結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定生物樣本中短鏈脂肪酸的含量”，既增加了學(xué)生接觸、使用多種大型分析儀器的機(jī)會(huì)，又使儀器分析實(shí)驗(yàn)更加全面、有趣和貼近實(shí)際應(yīng)用。通過本實(shí)驗(yàn)的開展，學(xué)生可以融會(huì)貫通有機(jī)化學(xué)知識(shí)和儀器分析知識(shí)，并能將這些知識(shí)轉(zhuǎn)化為解決生命健康、食品工藝優(yōu)化等實(shí)際問題的能力。此外，在本實(shí)驗(yàn)中，學(xué)生還進(jìn)一步加深了對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法、質(zhì)譜中多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)這些概念的認(rèn)識(shí)。該實(shí)驗(yàn)的開展，進(jìn)一步提高了學(xué)生綜合實(shí)驗(yàn)素質(zhì)，也有利于培養(yǎng)學(xué)生敢于探索新知精神。