鉬酸鹽功能化聚丙烯酰胺凝膠及其抗菌性能

＊韓耀 熊開容 龔鑫

（廣東工業大學環境科學與工程學院 廣東 510006）

病原微生物引起的疾病是一個日益嚴重的全球健康問題。例如，一些細菌、真菌、病毒等每年在世界各地造成數百萬人死亡[1]。細菌感染是不可忽視的主要原因，雖然可以用抗生素治療細菌和真菌感染，但抗生素的過度使用和使用不當導致多重耐藥細菌的出現[2]。在當今使用的許多抗菌材料中，通過將殺菌劑摻入聚合物或水凝膠中，隨后釋放[3]。常用的殺菌劑有銀納米顆粒[4]、銀鹽[5]、金屬氧化物[6]、鹵素[7]或季銨化合物[8-9]等，但是這些都存在某些限制。例如，銀基材料因其表現出優秀的體外殺菌性能而廣受歡迎，但在實際條件下表現出低功效[4]；雖然季銨鹽涂層通過破壞細菌的細胞質和外膜脂質雙層起作用，然而，其抗菌性能可能會根據表面環境條件（例如，pH值、水的硬度和血液的存在）而降低[8]。因此，開發具有高效殺菌性的凝膠是一個突出的挑戰。

聚丙烯酰胺（PAM）是水溶性線性高分子聚合物凝膠，具有親水性好、溶脹度高、比表面積大、吸附效果好、柔韌性高以及良好的生物相容性等特性[10]。然而單組分的PAM凝膠功能單一，雖然應用廣泛但有局限性，因而需要通過具有抗菌的無機材料對凝膠改性，增加其抗菌性能，同時也能提高其物理性能，例如抵抗外力延長使用壽命，實現凝膠的多功能化。多金屬氧酸鹽是一類金屬氧簇，具有多種結構和優異的特性，已知和抗生素及有機生物活性化合物具有協同作用，與蛋白質氨基酸相互作用，導致影響細菌細胞活力的生物反應[11-14]。多氧鉬酸鹽被證明具有高抗菌活性[15]。

基于以上思路，本文制備出一種由PAM、鉬酸銨、硝酸鈣、環己烷組成的鉬酸鈣納米簇凝膠（CMG），通過簡單的混合攪拌即可獲得。納米線由Ca2+橋接Mo7O246-納米團簇通過靜電相互作用形成，采用PAM和鉬酸鈣納米團簇（CMN）構建凝膠網絡體系。以表面含氨基化學官能團的PAM作為主體，利用其表面的氨基在自組裝過程中與納米線原位反應形成共價鍵，環己烷通過配位和靜電相互作用附著在納米線，增加了凝膠的界面穩定性。所制備的鉬酸鈣納米簇凝膠具有優異的孔隙率、保水性能等物理性質。所制備的凝膠具有優異的抗菌性能、高效及適應性廣等優點。

1.實驗

(1)實驗原材料

硝酸鈣（CN）：分析純，廣州化學試劑廠；鉬酸銨四水合物（AM）：分析純，上海麥克林生化有限公司；環己烷（CYH）：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇（EA）：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；聚丙烯酰胺（PAM）：分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；實驗用水均為去離子水。

(2)CMG凝膠的制備

稱取定量鉬酸銨在40℃下溶解于去離子水中。冷卻至室溫后，將一定質量的硝酸鈣加入反應溶液中并攪拌1h。隨后，分別取一定體積的環己烷和一定質量的PAM相繼加入混合溶液中。將混合溶液在60℃下攪拌24h。將產品用去離子水和無水乙醇離心洗滌多次，得到CMG。當鉬酸銨的質量為0.2g、0.5g、1.0g時，得到的樣品分別標記為CMG2、CMG5、CMG10。

(3)表征

通過掃描電子顯微鏡（德國蔡司公司Zeiss Gemini 300 SEM）觀察了凝膠的形態和大小。在SEM測試之前，將凝膠樣品冷凍干燥。

(4)凝膠含量

將凝膠稱重，記作W0，在通風櫥中干燥24h，然后在50℃下干燥48h直至達到恒定質量時，記作W1。

根據公式（1）計算凝膠含量G：

式中：W1是凝膠干重，g；W0為濕凝膠質量，g。

(5)水蒸氣透過率

將凝膠稱重，記作W0，在通風櫥中干燥24h，然后在50℃下干燥48h直至當達到恒定質量時，記作W1。將凝膠（Ws）保存在濕度為40%，溫度為37℃的保溫箱中。在固定的時間間隔后，測量質量（Wt）。

根據公式（2）計算凝膠保水率S：

式中：W1是凝膠干重，g；Ws為濕凝膠質量，g；Wt為保存不同時間的凝膠質量，g。

(6)孔隙率

采用液體置換技術分析了水凝膠的孔隙率。從每種類型的凝膠中使用3個樣品。將凝膠浸入乙醇中48h，直到它們被吸收飽和，然后重新稱量凝膠。

根據公式（3）計算凝膠孔隙率P：

式中：W0是凝膠干重，g；Ww為濕凝膠質量，g；WL為乙醇中凝膠的質量，g。

(7)抗菌評估

采用圓盤擴散法[13]對樣品進行體外抗菌實驗。首先，將金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）和大腸桿菌（ATCC 25922）接種到營養肉湯培養基中。分別取100μL大腸桿菌和金黃色葡萄球菌（約106CFU/mL）均勻分布在瓊脂平板上，將凝膠（直徑6mm）置于瓊脂平板上并在37℃下培養24h。測量并記錄抑制區半徑以評估抗菌活性。

(8)抗菌性能

根據平板計數法單位（CFU）對大腸桿菌（ATCC 25922）和金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）進行了實驗。凝膠在紫外燈下提前滅菌2h。首先，原菌活化后，將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別接種至營養肉湯液體培養基。隨后將細菌稀釋至105CFU/mL。將上述細菌懸浮液放入凝膠中后，在37℃下不斷振蕩2h。然后，從凝膠溶液中吸取100μL，將其稀釋至合適濃度的細菌懸浮液均勻涂布到營養肉湯瓊脂平板上，并在37℃恒溫培養箱中培養24h。之后，記錄細菌菌落并計數，實驗重復3次。

根據公式（4）計算殺菌率I：

式中：N空白和N實驗分別表示對照樣品和實驗樣品的細菌數量。

2.結果與討論

(1)CMG凝膠的微觀結構

圖1為凝膠表面的微觀形貌圖。雖然所制備的凝膠均表現出3D網格結構，但孔結構的微觀特征因凝膠中的鉬酸銨的量而異。CMG凝膠表現出不規則的開放交錯網和層狀結構。隨著鉬酸銨量的增加，孔壁加厚，孔壁變為相對規則和封閉，導致孔徑減小。這可能是由于凝膠制備過程中氫鍵的增加，導致冰晶的生長受限，并導致冷凍過程中CMN和PAM分子之間的水吸附競爭。這種加厚的孔壁由許多蜂窩狀的微孔組成，可以改善凝膠的孔隙率并增強毛細管作用。CMG復合凝膠的孔徑較小，可防止內部水分蒸發。

圖1 CMG的SEM圖

(2)CMG凝膠的物理性質

①凝膠含量

為了定量評價交聯度，對制備的水凝膠的凝膠含量進行了評價。從圖2可以看出，CMG2、CMG5和CMG10凝膠的凝膠含量分別為23.8%、14.5%和9.1%。當鉬酸銨數量增加至水凝膠結構重量的50%時，凝膠含量降低。

圖2 CMG凝膠含量（a）和含水率（b）

②孔隙率

凝膠的多孔結構有助于從傷口表面吸收大量滲出物。它還有助于營養分配，并為細胞的粘附和生長創造良好的環境。圖3為CMG凝膠的孔隙率圖。在這里，鉬酸銨的添加并沒有大程度影響凝膠的孔隙率，在85%～91%范圍內的孔隙率幾乎相同。水凝膠的高度多孔結構將支持從傷口表面吸附傷口滲出物，以幫助傷口愈合。

圖3 CMG的孔隙率

具有良好保濕性能的傷口敷料可以保持濕潤的傷口愈合環境。如圖4所示，鉬酸銨對CMG的保水率有明顯的影響。隨著鉬酸銨含量的進一步提高，CMG的保水率增加。37℃下1h后，CMG2、CMG5、CMG10的保水率分別為73.2%、80.9%、92.5%。CMG5具有優異的保水率和更小的孔徑，可以防止內部水分蒸發。綜上所述，CMG5具有良好的孔隙率和保水性，有助于吸收傷口滲出物并保持濕潤的愈合環境。

圖4 CMG的保水率

(3)CMG凝膠的抗菌活性

通過圓盤擴散法評估了CMG對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性，并統計了抑制區直徑。圖5為PAM、CMG2、CMG5、CMG10對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈照片。如圖6所示，PAM的抑制區直徑（IZD）等于0mm，沒有抗菌活性。CMG2對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的IZD分別為9.52mm和6.01mm，顯示出一定的抗菌活性，這歸因于鉬酸鹽釋放的鈣離子破壞了細菌膜，破壞了DNA復制。與CMG2相比，CMG5的IZD均顯著增加（p＜0.01），顯示出更有效的抗菌性能，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的IZD分別為9.46mm和8.13mm。換句話說，在相同劑量的硝酸鈣下，CMG5對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制程度是CMG10的1.3倍。說明過量的鉬酸銨會促進凝膠團簇的形成，從而減弱了抗菌活性。

圖5 PAM、CMG2、CMG5、CMG10凝膠對大腸桿菌（a）與金黃色葡萄球菌（b）的抑菌圈照片

圖6 CMG2、CMG5、CMG10凝膠對大腸桿菌（a）與金黃色葡萄球菌（b）的抑菌圈效果圖

(4)CMG凝膠的抗菌性能

圖7為凝膠在不同時間大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的活細菌數量。可見，CMG2和CMG5對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現出優良的抗菌性能，并具有抗菌持久性。如圖8所示，空白PAM表面所黏附的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的數量分別為1.30×107CFU/mL、2.03×107CFU/mL，與空白PAM相比，CMG2表面黏附的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的數量分別下降到前者的1.54%和35.22%。CMG5表面黏附的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的數量分別下降到前者的0.77%和27.09%。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在CMG10表面黏附的活細菌數量分別下降到空白PAM表面的44.62%和47.29%。結果表明，CMG凝膠具有一定的抗菌性能，且隨著鉬酸銨量的增加，CMG5對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌效果增強；但隨著鉬酸銨劑量的進一步升高，CMG10對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制呈下降趨勢，抗菌效果越差（對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有影響）。抗菌功能的顯著增強歸因于鉬酸鹽和鈣離子的協同功能。金屬離子的釋放是主要的滅菌途徑，但過量的鉬離子的存在導致離子釋放減弱。總之，CMG5對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現出優異的抗菌活性。

圖7 不同時間大腸桿菌（a）與金黃色葡萄球菌（b）的活細菌數量

圖8 聚丙烯酰胺凝膠、CMG2、CMG5、CMG10凝膠在2h時對大腸桿菌（a）與金黃色葡萄球菌（b）的抑菌效果圖

3.結論

鉬酸鹽和硝酸鈣通過靜電相互作用形成納米線，并通過配位和靜電相互作用與聚丙烯酰胺交聯，制備了一種抗菌凝膠。通過SEM進行了表征，相比于CMG2、CMG10凝膠，CMG5凝膠具有良好的孔隙率和保水性等物理性能。圓盤擴散法實驗表明所制備的CMG5凝膠對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制區直徑（IZD）分別為9.46mm和8.13mm。平板菌落計數法抗菌實驗表明所制備的抗菌凝膠對大腸桿菌的殺菌率達99.23%。綜上所述，該鉬酸鈣納米簇凝膠在抗菌、傷口敷料等領域具有巨大的應用潛力。