“冬病夏治”方中白芥子促進延胡索乙素經穴、非經穴部位皮膚滲透性比較研究

高遠，李冀，周夢丹，韓東衛?

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025；3.貴州醫科大學附屬醫院，貴州 貴陽 550001）

皮膚作為人體最大的器官是藥物經皮吸收的主要場所，具有給藥面積大、血管分布豐富的優勢［1-2］。但是，經皮給藥往往難以得到有效的血藥濃度，這是由于皮膚死亡細胞構成的角質層具有層狀緊密結構，極大阻礙了藥物通過皮膚，進入血液循環［3-4］。因此，降低角質層屏障作用、改善皮膚滲透性一直是經皮給藥研究需要攻克的難點問題。研究發現［5-6］，穴位部位皮膚表皮角質層較非穴位部位更薄，結締組織更加疏松，肥大細胞分布更加豐富，這種特殊的組織結構恰恰適合作為中藥透皮吸收的通道。

“冬病夏治”方出自《張氏醫通》，目前廣泛用于臨床，該方中白芥子、延胡索為君藥，其中白芥子味辛性溫，善走竄，是“內病外治”常用中藥［7-8］。《本草經疏性》稱白芥子：“味極辛，氣溫能搜剔內外”，可見其辛香走竄能力之強。體外透皮實驗表明［9-12］，白芥子能夠促進組方中鹽酸麻黃堿、黃芩苷、細辛脂素等多種中藥的有效成分透皮吸收，可以視其為一種特殊的中藥透皮吸收促進劑。本文將白芥子強大的促透能力和穴位特殊的組織結構聯系起來，提出白芥子穴位用藥的治療方案，從促進穴位吸收的角度開展研究，為探索穴位用藥的作用機制提供新思路。

本研究以“冬病夏治”方中君藥白芥子和延胡索作為“藥對組合”，以延胡索有效成分——延胡索乙素為指標，通過經穴、非經穴兩種途徑于類風濕性關節炎模型家兔皮膚給藥，考察有、無白芥子配伍以及經穴、非經穴這兩種途徑下，白芥子對延胡索乙素皮膚滲透的促進作用，旨在尋找到一種具有更優皮膚滲透性的外用給藥方案。

1 材料

1.1 動物

新西蘭家兔48只，雌雄各半，體質量1.5～2.0 kg，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，生產許可證：SCX黑2022005，飼養環境溫度20～25 ℃、濕度（45 ±5）%、12 h光照，飼養1周后進行造模，取材前禁食24 h。

1.2 儀器

Franz透皮擴散儀（天津市正通科技有限公司）；高效液相色譜儀（Waters 中國），配置QSM－FIN－TUV色譜工作站。

1.3 試藥

白芥子購自北京同仁堂股份有限公司，自制為白芥子粉，現用現粉碎；延胡索乙素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111902－202203）；甲醇為色譜醇（美國Dikma公司）；弗式完全佐劑（F5881－10 mL，美國Sigma公司）；卵蛋白（A5253，美國Sigma公司）。

2 方法

2.1 模型建立與分組

家兔背部取5個點，每個點皮下注射0.2 mL弗氏完全佐劑，作為首次致敏；第14天相同位置再次注射弗氏完全佐劑，加強致敏；第2次致敏第6天，雙膝關節腔內注射卵蛋白0.4 mL（濃度為10.0 mg/mL），作為誘發劑；3 d后膝關節腫脹達到最高峰，完成建模。

比較加入白芥子、不加白芥子體外釋放分組：將模型家兔隨機分為空白組（不加白芥子）、非經穴白芥子低劑量組（“冬病夏治”處方0.5倍量）、非經穴白芥子中劑量組（“冬病夏治”處方量）和非經穴白芥子高劑量組（“冬病夏治”處方2倍量）。

比較經穴、非經穴途徑體外釋放分組：將模型家兔隨機分為非經穴組（“冬病夏治”處方量）、“足三里”白芥子低劑量組（0.5倍處方量白芥子）、“足三里”白芥子中劑量組（處方量白芥子）和“足三里”白芥子高劑量組（2倍處方量白芥子）。

2.2 延胡索乙素分析方法的建立

2.2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS（2.1 mm × 75 mm，1.8 μm）；流動相：甲醇－0.1%甲酸水（62∶38三乙醇胺調節至pH值為6）；流速：0.3 mL/min；檢測波長：280 nm；進樣體積：2 μL；柱溫：30 ℃。

2.2.2 對照品溶液制備

精密稱取延胡索乙素對照2.5 mg，置于25 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻后得到0.1 mg/mL對照品儲存液，4 ℃條件下保存備用。

2.2.3 樣品溶液的制備

樣品液過0.22 μm微孔濾膜，-20 ℃冰箱保存。精密取擴散池續濾液，按“2.2.1”項下色譜條件進行UPLC檢測。

2.2.4 線性關系考察

精密吸取“2.2.2”項下儲備液，乙醇定容，制備成0.001、0.002、0.004、0.01、0.02、0.1 mg/mL系列對照品溶液，在“2.2.1”項下色譜條件進行檢測，以藥物峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.2.5 專屬性試驗

按“2.2.2”項下方法制備空白溶液，甲醇定容，微孔濾膜過濾，按“2.2.1”項下色譜條件進行UPLC檢測。

2.2.6 精密度試驗

精密稱取0.001、0.004、0.1 mg/mL對照品溶液，平行進樣6次，按“2.2.1”項下色譜條件進行UPLC檢測。

2.2.7 加樣回收率試驗

精密稱取“2.2.2”項下延胡索乙素對照品溶液，加入不含藥的透皮接收液，5 mL容量瓶定容，配制成0.001、0.004、0.1 mg/mL溶液，每個質量濃度3份。

2.3 體外透皮實驗

2.3.1 穴位定位

穴位部位選取家兔膝關節“足三里”穴位（位于后肢外側，脛骨粗隆下約0.3 cm處）。非經穴部位選擇脛骨邊緣外側，足三里旁開1～2 cm處（注意避開經絡線）。

2.3.2 離體皮膚處理

剪掉模型家兔膝關節部位較長的兔毛，脫毛膏除去絨毛，再將家兔處死。按照“2.3.1”項下定位取“足三里”穴位處、足三里旁開處（非穴位區），得到面積約1.5 cm2的圓形皮膚，刀片刮掉皮下脂肪組織，生理鹽水清洗后，4 ℃下保存備用。

2.3.3 離體透皮試驗

將處理好的皮膚固定于Franz透皮擴散儀，設置恒溫水浴溫度36.8 ℃，磁力攪拌轉速200 r/min。接收室內放入轉子，注入5 mL生理鹽水（使用前超聲脫氣）。平衡實驗條件0.5 h之后，按照“2.1”項下分別將白芥子－延胡索乙素糊狀物均勻涂于離體皮膚，置于擴散室和接收室之間，保持角質層一側向上，接口面積為0.636 cm2，接收室體積5 mL。于0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12 h分別取樣1.0 mL，同時補充相同體積的生理鹽水。按照“2.2.1”項下色譜條件測定延胡索乙素含量，利用累計釋放公式計算單位面積累積透過量和百分比。

其中，Q（mg/cm2）為累積透過量，Cn和Ci分別代表為第n時間點、i個取樣點測得的質量濃度（mg/mL），A為滲透面積（cm2），M為理論含藥量。

穩態滲透速率為Q/h，該時間為累積透過量－時間曲線圖的直線部分的斜率，本實驗平均5～6 h區間內。以累積滲透率（Q%）為縱坐標，以時間（t）為橫坐標得到透皮吸收曲線；進行線性回歸，得到體外滲透參數和釋放曲線。

2.4 統計學方法

應用SPSS20.0統計軟件進行分析，多組間采用單因素方差分析，配對t檢驗兩組間差異（置信區間95%），相關系數顯示該條件下適合進行配對t檢驗比較顯著性。P＜ 0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 模型建立與分組結果

按照“2.1”項下方法造模，3 d后關節腫脹度為正常狀態下2倍左右，且出現體溫上升，飲食下降、活動減少的狀態，表明造模成功。

3.2 延胡索乙素分析結果

按照“2.2”項下方法，建立分析方法，回歸方程為Y= 9 567.4X－5 422.4（R= 0.999 87）。色譜峰型良好，出峰位置無干擾，專屬性良好；精密度試驗測得RSD分別為1.97%、1.52%、0.99%，表明儀器精密度良好；加樣回收率試驗測得平均加樣回收率為98.49%，RSD為1.22%。

3.3 體外透皮實驗結果

白芥子配伍下，累積透過量、穩態滲透速率均優于缺少白芥子的組別。隨著白芥子用量增加，累積透過量、穩態滲透速率均有提高，且高劑量組 ＞ 中劑量組 ＞ 低劑量組。見表1。“足三里”經穴給藥的條件下累積透過量、穩態滲透速率均優于非經穴給藥。隨著白芥子用量增加，累積透過量、穩態滲透速率均有提高，且高劑量組 ＞ 中劑量組 ＞ 低劑量組。見表2。白芥子配伍的條件下，12 h內累積滲透率顯著優于缺少白芥子的組別。隨著白芥子用量增加，累積滲透率顯著提高。見圖1。“足三里”經穴給藥的條件，12 h內累積滲透率顯著優于非經穴給藥。隨著白芥子用量增加，累積滲透率顯著提高。見圖2。

圖1 白芥子促延胡索乙素累積滲透率曲線圖

圖2 白芥子促延胡索乙素經穴、非經穴累積滲透率曲線圖

表1 各組延胡索體乙素體外滲透參數表（ ± s，n = 6）

表1 各組延胡索體乙素體外滲透參數表（ ± s，n = 6）

組別空白組（不加白芥子）非經穴白芥子低劑量組非經穴白芥子中劑量組非經穴白芥子高劑量組回歸方程Y = 0.022 2X + 0.004 7 Y = 0.029 1X + 0.036 8 Y = 0.040 7X + 0.048 2 Y = 0.052 8X + 0.054 6穩態滲透速率［mg/（cm2·h）］0.320 0.467 0.643 0.782相關系數R2 = 0.990 6 R2 = 0.968 5 R2 = 0.951 7 R2 = 0.962 6累積透過量（mg/cm2）2.02 ± 0.30 2.96 ± 0.31 3.70 ± 0.35 4.94 ± 0.40

表2 各組延胡索乙素經穴、非經穴體外滲透參數表（ ± s，n = 6）

表2 各組延胡索乙素經穴、非經穴體外滲透參數表（ ± s，n = 6）

組別非經穴組“足三里”白芥子低劑量組“足三里”白芥子中劑量組“足三里”白芥子高劑量組回歸方程Y = 0.040 7X + 0.048 2 Y = 0.051 5X + 0.080 2 Y = 0.064 4X + 0.112 1 Y = 0.078 3X + 0.103 1相關系數R2 = 0.951 7 R2 = 0.943 7 R2 = 0.921 7 R2 = 0.933 4累積透過量（mg/cm2）3.70 ± 0.35 5.01 ± 0.37 6.20 ± 0.41 7.49 ± 0.49穩態滲透速率［mg/（cm2·h）］0.643 0.905 1.128 1.435

3.4 統計學分析結果

白芥子高、中、低三組累積透過量均顯著高于不加白芥子的空白組（P＜ 0.01），促滲透倍數隨白芥子劑量提高而增加，即高劑量組 ＞ 中劑量組 ＞ 低劑量組。見表3。經穴給藥的白芥子高、中、低三組累積透過量均顯著高于非經穴組（P＜ 0.01），促滲透倍數隨白芥子劑量提高而增加，即高劑量組 ＞ 中劑量組 ＞ 低劑量組，表現出滲透性對白芥子用量的依賴性。見表4。

表3 白芥子促延胡索乙素滲透配對t檢驗

表4 白芥子促延胡索乙素滲透經穴、非經穴配對t檢驗

4 討論

一直以來，透皮吸收量少、血藥濃度低、累積釋放量達不到有效濃度是制約中藥經皮制劑發展的難題。因此，無論是制備微乳、柔性脂質體等被動促進滲透方法，還是微針和離子導入，其最終目的都是降低角質層屏障作用，提高藥物進入血液循環的量。而人體穴位部位恰恰具有角質層較薄、循經低電阻的特點，是藥物經皮滲透的特殊通道。本文中非經穴（處方量）組與空白組給藥方式、劑量是相同的，但不在同一批次，分別作為給藥部位、給藥劑量研究的對照，因此文中分為兩組。

祝總驤等［13］在100名受試者的經絡上進行皮膚阻抗測試，發現經絡上所有穴位均有角質層薄、低電阻的特性。這是因為在穴位部位，由死亡細胞組成的角質層更薄，導電性更強，具有低電阻特性。安賀軍［14］利用體表電阻檢測法對穴位處電阻進行檢測，結果發現，不同穴位間存電阻在差異，但是均低于非穴位部位，其中“足三里”和非穴位平均阻抗分別為（11.61 ± 2.09）（19.83 ± 2.39） Ω/m2，明顯存在差異，可見二者角質層厚度差異顯著。本文發現延胡索乙素“足三里”累積釋放量顯著高于非經穴，與上述研究結論一致，表明穴位作為給藥部位更有利于有效成分透皮吸收。

以往透皮滲透研究中，往往將中藥方劑中的單味藥作為研究重點，忽視了藥物配伍的相互作用。越來越多的研究［15-17］表明，古代經驗方中的一些藥物不但有藥理作用，同時能夠起到透皮吸收促進劑的作用，能夠促進方中其他藥物透皮吸收，特別是具有大量揮發性成分的中藥，其促進透皮效果尤為顯著，起到藥物和輔料（透皮促進劑）的“雙重”作用，實現了“藥輔合一”。本文將“冬病夏治”方中君藥白芥子、延胡索組成“藥對”，發現胡索乙素累積透過量、穩態滲透速率、累積滲透率3種滲透參數均隨著白芥子用量提高而增加，具有劑量依賴性，結合穴位給藥和白芥子透皮促進的“雙重”作用，得到了一種更好的中藥外用給藥方案。穴位部位的形態結構、生物物理特性具有明顯特異性［18-20］，中藥的經穴吸收過程與非經穴吸收也必然存在差異。但是，藥物透皮吸收后，在體內分布、轉運、排泄的路徑是否也存在特異性，藥物與穴位間是否有相互作用，還需進一步研究。