苓桂術甘湯對壓力負荷致心衰小鼠心功能、腸道屏障和菌群的影響

張紅霞，陳瑤，趙鑫，邱先哲，李玉紅?

（1.天津中醫藥大學第二附屬醫院，天津 300250； 2.天津中醫藥大學，天津 301617）

心力衰竭（heart failure，HF）是指由于各種原因引起心臟結構或功能異常導致心室充盈障礙或射血功能下降而出現的一組復雜臨床綜合征［1］。2018年我國HF患病人數約450萬［2］；歐美國家HF成人患病率為1%～2%，且患病率隨年齡增加而增長，70歲以上人群的HF患病率超過10%［3-4］。苓桂術甘湯出自漢代張仲景《金匱要略》，具有溫陽化飲、利水降逆的功效。臨床研究表明苓桂術甘湯可以改善HF患者的心功能，提高患者生活質量，療效明確［5-6］。近年來有研究表明，腸道菌群通過介導短鏈脂肪酸（Short－chain fatty acid，SCFA）、膽汁酸代謝等途徑參與HF的疾病進展［7］。因此，本實驗應用16S rRNA高通量測序，探索苓桂術甘湯對主動脈弓縮窄術（transverse aortic constriction，TAC）誘導的HF小鼠心功能、腸道屏障和腸道菌群的作用。

1 材料和方法

1.1 動物

雄性C57BL6/J小鼠，8～10周齡，40只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCKK（京）2016－0006。飼養于天津中醫藥大學實驗動物中心，SPF級，溫度（22 ± 2）℃，相對濕度50%～60%，12 h光照/黑暗環境，自由攝食、飲水。

1.2 試劑與儀器

使用DNA抽提試劑盒（美國Bio－Tek公司）；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（美國Axygen公司）；FastDNASPINKitfor Soil（美國MP公司）；ZO－1（1∶1 000，Invitrogen）；Occludin（1∶1 000，Invitrogen）；βactin（1∶1 000，Santa Cruz）；Illumina MiSeq platform（美國Illumina 公司）；MISEQ測序儀和HISEQ測序儀（美國Illumina公司）；Vevo2100TMB型超高分辨率小動物超聲實時影像系統（加拿大VisuaISonics Inc）。

1.3 苓桂術甘湯的制備

苓桂術甘湯由茯苓12 g，桂枝9 g，白術6 g，炙甘草6 g組成，所有藥材均購自北京同仁堂股份有限公司，藥材按原方比例加入蒸餾水浸泡30 min后，大火煮開并計時30 min，收集藥液；再次加入蒸餾水大火煮開后計時30 min，收集藥液。將兩次的藥液混合，濃縮，凍干制成凍干粉，保存于4 ℃冰箱。實驗前，將干燥凍干粉溶于蒸餾水中。

1.4 造模與分組

小鼠適應性喂養1周后，采用主動脈弓縮窄術（TAC）模擬壓力負荷誘導小鼠HF模型。手術前，小鼠禁食8 h，腹腔注射三溴乙醇（122 mg/kg）進行麻醉，用脫毛劑去除小鼠胸毛，消毒后在鎖骨上方胸部中線附近切口約1～1.5 cm。采用鈍性分離逐漸暴露主動脈弓，使用5-0絲線疊加27G針頭，在頭臂動脈和左側頸總動脈之間結扎，結扎后立即取出針頭。假手術組（Sham，n= 7）小鼠只穿線，不結扎；術后1周，將小鼠按心臟射血分數隨機分為TAC模型組（TAC，n= 7）、苓桂術甘湯低劑量組（LD－L，n= 6，4.29 g/kg）和苓桂術甘湯高劑量組（LD－H，n= 7，8.58 g/kg），其中低劑量相當于人臨床等效劑量，模型組灌胃蒸餾水，共8周。

1.5 心臟彩色多普勒超聲儀評價小鼠心功能

在異氟烷（0.25%～0.50%）氣體麻醉條件下，利用超高分辨率小動物超聲儀器檢測小鼠左室舒張末期內徑（left ventricular end diastolic diameter，LVESD）、左室收縮末期內徑（left ventricular end systolic diameter，LVESD）、射血分數（ejection fraction，EF，%）、短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，FS，%）。結果均取3個連續心動周期的平均值。

1.6 蛋白質印跡法（Western blot）

取同一位置的結腸組織提取總蛋白并定量，電泳，轉膜2 h，封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，二抗常溫孵育1.5 h，TBST洗滌5次，6 min/次，使用Amersham Imager 600凝膠成像系統掃描，Image－J、Gelpro32軟件計算目標條帶和內參條帶的灰度值，統計緊密連接帶狀閉合蛋白（zonula occluden，ZO）－1和緊密連接咬合蛋白（Occludin）的蛋白表達。

1.7 16S rRNA高通量測序

采用DNA提取試劑盒、NanoDrop 2000和1%瓊脂糖凝膠電泳分別提取總DNA、檢測DNA濃度、純度和提取質量。使用338F：5'－ACTCCTACGGGAGGC AGCAG－3'和806R：5'－GGACTACHVGGGTWTCTA AT－3'引物在V3～V4可變區擴增后，利用Illumina MiSeq平臺測序。

1.8 統計學方法

實驗結果以均數 ± 標準差表示。采用SPSS22.0軟件進行統計分析，多組間檢驗采用單因素方差分析，兩組間檢驗采用獨立樣本t檢驗（Student'sttest或Welch'sttest）。P＜ 0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 心功能

與Sham組小鼠比較，TAC組小鼠LVEDD、LVESD均顯著升高（P= 0.004 7，0.000 0），EF、FS顯著降低（均P= 0.000 0），提示TAC導致小鼠心臟功能嚴重受損，HF模型建立成功。與TAC組小鼠比較，LD－H可以顯著降低LVEDD（P= 0.003 0）；LD－L和LD－H均可以顯著降低LVESD（P= 0.001 6，0.000 1），并且顯著升高EF、FS（P= 0.000 0），提示苓桂術甘湯可以改善TAC小鼠的心功能。結果見圖1。

圖1 各組HF小鼠心功能的比較

2.2 小鼠結腸組織ZO－1和Occludin蛋白相對表達水平

ZO－1和Occludin是腸道緊密連接的關鍵蛋白，是腸黏膜機械屏障的最主要組成部分。與Sham組比較，TAC組小鼠結腸組織中ZO－1和Occludin蛋白表達水平均顯著下降（P= 0.000 0，P= 0.016 3）；與TAC組比較，LD－L、LD－H治療均可不同程度的恢復ZO－1（P= 0.000 0，P= 0.000 0）和Occludin（P=0.041 8，P= 0.019 5）蛋白表達水平，差異具有統計意義。結果見圖2。

圖2 各組HF小鼠結腸組織ZO－1及Occludin蛋白表達的比較

2.3 腸道菌群的多樣性

4組小鼠腸道菌群alpha多樣性結果相比較，在群落豐富度（ace、sobs、chao）、多樣性（shannon）、均一性（shannoneven、simpsoneven）均具有顯著性差異（F=7.474 6，P= 0.001 3；F= 7.292 8，P= 0.001 4；F=9.878 7，P= 0.000 3；F= 9.561 4，P= 0.000 3；F=8.796 5，P= 0.000 5；F= 3.759 9，P= 0.025 5）。與Sham組相比，TAC組shannon（P= 0.001 4）、shannoneven（P= 0.000 9）和simpsoneven（P= 0.030 4）指數顯著降低。與TAC組相比，LD－L組ace（P=0.040 9）、sobs（P= 0.038 1）、chao（P= 0.017 4）、shannon（P= 0.007 7）、shannoneven（P= 0.009 6）指數顯著升高；LD－H組ace（P= 0.000 5）、sobs（P= 0.000 2）、chao（P= 0.000 1）、shannon（P= 0.000 0）、shannoneven（P= 0.000 1）、simpsoneven（P= 0.003 7）指數顯著升高。說明TAC誘導的HF小鼠腸道菌群多樣性和均一性降低；苓桂術甘湯有助于上調HF小鼠腸道菌群群落豐富度、多樣性和均一性。基于Bray_curtis距離算法的主坐標分析（Principal Coordinates Analysis，PCoA）和UPGMA分析，可以觀察小鼠腸道菌群beta多樣性的差異。結果顯示，PC1對總體菌群的代表性為19.62%，PC2為14.52%，各組基本可以聚集在一定的范圍之內，Sham組和TAC組之間有明顯的微生物群落差異，苓桂術甘湯（LD－L和LD－H）治療后，微生物群落逐漸趨于Sham組，說明苓桂術甘湯有助于調節HF小鼠腸道菌群結構。具體見圖3。

圖3 各組對TAC誘導的HF小鼠腸道菌群多樣性的分析

2.4 腸道細菌的相對豐度

小鼠腸道細菌中norank_f_Muribaculaceae、Lactobacillus和Akkermansia均表現出較高的豐度。在屬水平方面，與Sham組相比，TAC組norank_f_Muribaculaceae和Prevotellaceae_NK3B31_group相對豐度顯著較低，苓桂術甘湯治療可以升高他們的相對豐度（與TAC組比較）。此外，苓桂術甘湯對Parabacteroides相對豐度也有上升趨勢。結果見圖4A。在種水平方面，uncultured_bacterium_g_norank_f_Muribaculaceae、Lactobacillus_murinus、uncul tured_bacterium_g_Prevotellaceae_NK3B31_group、uncul tured_organism_g_Parabacteroides均具有顯著性差異（H= 15.391 0，P= 0.002 0；H= 8.214 0，P= 0.042 0；F= 8.048 7，P= 0.000 8；H= 10.451 0，P= 0.015 0）。結果見圖4B。與Sham組相比，TAC組uncultured_bacterium_g_norank_f_Muribaculaceae相對豐度明顯降低（P= 0.002 0）；Lactobacillus_murinus相對豐度升高（P= 0.042 0）。與TAC組相比，苓桂術甘湯治療明顯上調norank_f_Muribaculaceae（P= 0.028 0、0.015 0）、uncultured_bacterium_g_Prevotellaceae_NK3B31_group（P= 0.020 0）和uncultured_organism_g_Parabacteroides的相對豐度，下調Lactobacillus_murinus的相對豐度。

圖4 屬和種水平菌群組成分析及差異檢測

2.5 關聯與模型預測分析

采用Spearman相關系數，在屬水平下對EF、FS、LVEDD、LVESD在不同分類水平下的腸道菌群豐度之間的相關性進行預測。在屬水平方面，norank_f_Muribaculaceae與EF、FS均呈正相關；與LVEDD、LVESD均呈負相關。Lactobacillus與LVEDD、LVESD均呈正相關，與EF、FS均呈負相關。結果見圖5。

圖5 屬水平菌群豐度與EF、FS、LVEDD、LVESD的相關性Heatmap圖

3 討論

正常情況下，腸道菌群與人體保持著共生的協調關系，參與宿主體內多種代謝，生成氧化三甲胺、SCFA和膽汁酸等，并通過激活多種信號通路影響宿主的生理過程。有研究表明，HF患者心排血量減少，導致全身充血和灌注不足、腸黏膜缺血或水腫，進而腸道通透性增加、細菌移位增加，乃至進入外周循環系統的內毒素增加，引發全身炎癥反應，加重HF的疾病進展［8］。因此，腸道菌群已成為探索HF治療領域的新視點。腸道菌群具有促進營養物質吸收、能量代謝調控、免疫功能調節等多方面功能，分別與中醫理論的脾主化生氣血、脾主運化、脾為之衛等方面的功能相契合，可見腸道菌群與中醫之“脾”關系密切。苓桂術甘湯是溫陽健脾利水的經典名方，大量臨床研究證實，苓桂術甘湯可以明顯改善HF患者的心功能和生活質量［5-6］。目前還沒有關于苓桂術甘湯對HF小鼠腸道菌群是否具有調節作用的相關報道，故本實驗采用16S rRNA高通量測序技術探究苓桂術甘湯對TAC誘導的心衰小鼠腸道菌群結構的影響。

本研究采用TAC壓力負荷誘導小鼠HF模型［9］。結果表明，模型組小鼠出現明顯的心功能障礙，表現為LVEDD、LVESD顯著升高，EF、FS顯著下降，而高、低劑量的苓桂術甘湯治療后均可顯著改善心衰小鼠的心功能。

腸屏障功能障礙是HF發生的觸發因素。臨床研究表明，HF患者腸壁厚度增加，腸道通透性增加以及腸道功能不全［10］。心衰患者的心排血量減少，腸道的血液灌流減少，影響了腸壁絨毛的結構，導致不同類型的腸細胞功能損傷，腸屏障的完整性受損，腸道通透性增加，從而使過量的細菌及代謝產物、內毒素進入循環系統。ZO－1和Occludin在腸黏膜損傷修復中發揮著重要作用，是衡量腸黏膜機械屏障的重要指標［11］。本研究表明，與假手術組相比，TAC組小鼠結腸組織中ZO－1、Occludin蛋白表達明顯下調，提示HF小鼠腸黏膜機械屏障受損；苓桂術甘湯干預后，小鼠結腸組織ZO－1、Occludin蛋白表達水平明顯升高，提示苓桂術甘湯能夠保護HF小鼠腸黏膜屏障。

此外，通過對HF小鼠糞便樣本進行菌群多樣性分析，筆者發現HF小鼠腸道細菌多樣性明顯降低，細菌豐度也有下降趨勢；苓桂術甘湯治療后，細菌豐度及多樣性明顯升高，且結合beta多樣性結果分析，苓桂術甘湯治療后，微生物群落逐漸趨于假手術組，說明苓桂術甘湯有助于恢復HF小鼠腸道菌群的豐度和多樣性。

高劑量苓桂術甘湯治療后，Muribaculaceae相對豐度明顯升高，Parabacteroides和Prevotellaceae_NK3B3 1_group相對豐度有升高趨勢。有研究表明，Parabacteroides可以通過降低炎癥和胰島素抵抗水平，增強腸道完整性，進而發揮抗肥胖的作用［12］。CMATZIOURIDOU等［13］發現，Parabacteroides與抗動脈粥樣硬化有關。CHEN等［14］發現，SCFA產生菌的減少可能是TAC誘導HF的顯著特征，并且心衰患者中亦發現了SCFA產生菌的減少。腸道微生物介導的SCFA代謝途徑可以通過多種途徑抑制機體炎癥反應，發揮抗HF的重要作用［15］。SMITH等［16］和LIU等［17］研究發現，Muribaculaceae、Prevotellaceae_NK3B31_group的豐度與SCFA的產生密切相關［16-17］。此外，Prevotellaceae_NK3B31_group 豐度減少，與炎癥發生具有一定的相關性［18］。

此外，本實驗發現，TAC小鼠腸道乳酸桿菌屬（Lactobacillus）的相對豐度顯著增加，苓桂術甘湯能顯著降低其豐度。LI等［19］和ZHENG等［20］發現，在Dahl鹽敏感性高血壓誘導的HF大鼠及異丙腎上腺素誘導的HF大鼠腸道中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）的相對豐度均明顯降低［19-20］；BOCCELLA等［21］發現，在TAC誘導的HF小鼠腸道中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）的相對豐度均顯著升高。并且有臨床研究表明在老年HF患者和ST段抬高型心肌梗死患者腸道中，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）的相對豐度均增加［17，22］。本實驗發現，TAC小鼠腸道中Lactobacillus_murinus的相對豐度明顯增加，苓桂術甘湯治療后該菌相對豐度降低。Lactobacillus_murinus被認為是一種特殊的“高血壓細菌”，可以調節一氧化氮水平、血管緊張素轉化酶抑制劑活性和脂多糖產生［23］。此外，WILCK等［24］發現，Lactobacillus_murinus可以通過調節TH17細胞，進而預防高鹽誘發的小鼠鹽敏感性高血壓，并且在人體腸道菌群中證實了該作用。因此，關于乳酸桿菌屬（Lactobacillus）在HF疾病發展中的變化及苓桂術甘湯調節的因果關系仍需進一步的深入研究。

綜上所述，本研究發現苓桂術甘湯能有效改善心衰小鼠心功能，修復腸黏膜屏障，調節腸道細菌結構紊亂，促進短鏈脂肪酸產生相關菌生長。