LncRNA-MAFG-AS1在結直腸癌中的表達及臨床意義

郝英豪，林 林

(河北醫科大學第二醫院普外三科，河北 石家莊 050000)

據我國最新腫瘤流行病數據顯示，我國結直腸癌發病率和病死率已位居惡性腫瘤前列，發病率呈逐年上升趨勢[1]。結直腸癌發病隱匿，早期無明顯臨床癥狀，大部分患者確診時已處于中晚期，失去了根治的機會，目前臨床上已有多種治療手段，包括手術、放化療及靶向治療等，但患者預后并沒有得到明顯改善，5年生存率較低[2]。早期結直腸癌患者的5年相對生存率達90%，但晚期僅約10%[3]。因此，深入研究結直腸癌的發病機制以期為開發針對性治療策略是當前必要而緊迫的醫學問題，但結直腸癌發病過程涉及多種機制和過程，從分子生物學水平探討結直腸癌的發病機制及標志物已成為精準治療的前沿方向。近年研究表明，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在惡性腫瘤的發病過程中發揮關鍵作用，主要通過調控表觀遺傳、轉錄水平及轉錄后水平影響靶基因的表達參與腫瘤的發生發展[4-5]。在腫瘤診治方面具有重要的科學研究和臨床價值。Mo等[6]首先發現MAFG-AS1 與胃癌發生發展密切相關。后續又有研究發現在骨肉瘤細胞中MAFG-AS1 高表達，下調MAFG-AS1 可抑制骨肉瘤細胞生長[7]。但LncRNA MAFG-AS1 在結直腸癌的作用仍未闡明。研究其在結直腸癌發生發展中的作用及臨床意義將為診治結直腸癌提供新的突破。本研究擬檢測LncRNA MAFG-AS1 在結直腸癌組織中表達情況，并分析其與臨床病理特征的聯系及探討在預后評估當中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年1月—2015 年1月在我院行手術切除的結直腸癌組織及癌旁正常組織各80例，其中，男性42 例，女性38例，年齡35～75歲，平均(54.68±5.87)歲，其中結腸癌39例，直腸癌41例；Ⅰ期患者10例，Ⅱ期患者21例，Ⅲ期患者25例，Ⅳ期患者24例。納入標準：①術中切除組織病理證實為結直腸癌，術前未行放化療和靶向治療；②完整的臨床資料及隨訪資料；③簽署知情同意書。排除標準：①非原發性結直腸癌；②合并其他腫瘤。患者術后均隨訪，隨訪截止時間為2019年12月31日。

本研究經醫院科研倫理委員會審查通過。

1.2主要試劑及儀器 從寶日(中國)生物技術有限公司購入TRIzol 提取試劑、PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time RNA 反轉錄試劑盒，由上海生工生物公司設計合成引物序列，使用購自Life公司的ABI7500定量PCR儀和購自美國Thermo公司的NanoDrop 2000超微量分光光度計。

1.3qRT-PCR 檢測LncRNA-MAFG-AS1的表達 用TRIzol提取試劑提取結直腸癌組織和癌旁組織中的總RNA，并檢測總RNA濃度和純度，當a260/280的數值在1.8～2.1即為純度較高，置于-80 ℃存貯待用。通過反轉錄試劑盒將RNA進行逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板行PCR 擴增，選用GAPDH為內參，引物序列見表1，反應體系見表2。反應程序為：95 ℃預變性5 min，1個循環；95 ℃變性30 s、60 ℃退火延伸1 min，40個循環；72 ℃延伸1 min，1個循環。采用2- △△Ct分析LncRNA-MAFG-AS1 mRNA相對表達量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

表2 反應體系Table 2 Reaction system

1.4統計學方法 應用SPSS 22.0統計學軟件對數據進行分析。計量資料比較采用t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。應用Kaplan-Meier(K-M)法分析生存曲線，通過Cox 回歸模型分析結直腸癌患者預后的獨立影響因素。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1LncRNA-MAFG-AS1在結直腸癌和癌旁正常組織的表達情況 結直腸癌組織中LncRNA-MAFG-AS1相對表達量明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義(2.398±0.214vs.1.032±0.132，t=9.032，P<0.05)。

2.2LncRNA-MAFG-AS1與結直腸癌不同臨床病理特征相關性分析 LncRNA-MAFG-AS1的過表達在患者不同TNM分期組及有無淋巴結轉移組和有無遠期轉移組組間差異有統計學意義(P<0.05)，而在不同年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤位置、血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)水平組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 LncRNA-MAFG-AS1在結直腸癌不同臨床病理特征組間差異的比較Table 3 Comparison of differences in LncRNA-MAFG-AS1 in CRC patients with different clinicopathological features

2.3LncRNA-MAFG-AS1與結直腸癌患者預后的關系 隨訪60個月，中位隨訪時間39個月，以LncRNA-MAFG-AS1表達量的中位值將患者分為低表達組(n=29)和高表達組(n=51)，K-M生存分析顯示高表達患者無進展生存時間(progression-free survival，PFS)為(20.36±3.21)個月，低表達患者為(29.71±4.23)個月；高表達患者的總生存時間(overall survival，OS)為(38.69±6.24)個月，低高表達患者為(54.26±5.14)個月；兩組患者的PFS和OS差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 LncRNA-MAFG-AS1低表達與高表達患者的PFS與OS生存曲線A.LncRNA-MAFG-AS1低表達與高表達患者的PFS生存曲線；B.LncRNA-MAFG-AS1低表達與高表達患者的PFS與OS生存曲線Figure 1 Survival curves of PFS and OS of patients with low and high expression of LncRNA-MAFG-AS1

2.4結直腸癌患者預后的影響因素分析 單因素Cox回歸分析結果顯示患者的 PFS 和 OS與年齡、性別，腫瘤大小，腫瘤位置無關(P>0.05)，而與TNM分期更高、中高分化及存在淋巴結轉移、遠期轉移以及CEA水平>10 ng/L及LncRNA-MAFG-AS1高表達有關(P<0.05)。將具有顯著性的單影響因素進行Cox多因素回歸分析，結果顯示，TNM分期更高、中高分化及存在淋巴結轉移、遠期轉移以及LncRNA-MAFG-AS1 高表達是影響結直腸癌預后的獨立危險因素。見表4，5。

表4 結直腸癌患者預后影響因素的Cox單因素分析Table 4 Univariate Cox analysis of prognostic factors in patients with colorectal cancer

表5 結直腸癌患者預后影響因素的Cox多因素分析Table 5 Multivariate Cox analysis of prognostic factors in patients with colorectal cancer

3 討 論

結直腸癌是常見的胃腸道惡性腫瘤之一，近年來，結直腸癌的發病率逐年增加，給患者和社會帶來沉重負擔，盡管近年隨著液體活檢和靶向治療技術的應用，結直腸癌診治水平取得較大突破，但其確診晚、進展快，5年生存率仍然較低[8-9]。在我國，結直腸癌已經成為了威脅居民生命健康的主要癌癥之一，雖然結直腸癌的病因尚不明確，但通過大量的研究已經發現與結直腸癌家族史、炎癥性腸病、紅肉和加工肉類攝入、糖尿病、肥胖、吸煙、大量飲酒等因素有關的，因此，保持良好的生活方式可以降低結直腸癌的發病風險[10]；同時結直腸癌發生、轉移及復發過程涉及多種基因異常表達，故深入探討結直腸癌發病過程中異常表達的基因對于探索有效的診斷和治療方法具有更加重要的臨床意義[11]。

自2002年Okazaki首次發現LncRNA以來，近二十年來不斷發現新的與腫瘤發生、發展密切相關的LncRNA，通過調控腫瘤細胞的增殖、遷移及凋亡等過程，進而影響腫瘤患者的療效和預后生存。近年來，研究LncRNA已成為精準醫學關注的重點方向，但目前對LncRNA的生物學機制研究只是微乎其微，還需要國內外學者共同深入研究。先前文獻報道已經證實了LncRNA在結直腸癌的發病過程中有重要作用[12]。LncRNA-MAFG-AS1定位于17q25，屬于新發現的一類LncRNA，有研究指出其在肺腺癌和乳腺癌中表達異常[13-15]，但尚未在結直腸癌研究中報道。

本研究通過實時熒光定量PCR法檢測LncRNA-MAFG-AS1在結直腸癌組織及癌旁正常組織中的表達，探討其臨床意義，結果顯示：結直腸癌組織LncRNA-MAFG-AS1表達明顯高于癌旁正常組織；通過對LncRNA-MAFG-AS1與結直腸癌不同臨床病理特征相關性的分析，結果顯示，LncRNA-MAFG-AS1的過表達與患者TNM分期更高、中高分化及存在淋巴結轉移和遠期轉移有關(P<0.05)；通過對LncRNA-MAFG-AS1與結直腸癌患者預后關系的分析，K-M生存分析結果顯示：高表達患者的PFS為(20.36±3.21)個月，低表達患者為(29.71±4.23)個月；高表達患者的OS為(38.69±6.24)個月，低高表達患者為(54.26±5.14)個月；兩組患者的PFS和OS差異有統計學意義(P<0.05)；Cox多因素回歸分析結果顯示：TNM分期更高、中高分化及存在淋巴結轉移、遠期轉移以及LncRNA-MAFG-AS1 高表達是影響結直腸癌預后的獨立危險因素。通過分析實驗結果，發現LncRNA-MAFG-AS1表達異常可能參與了結直腸癌發生過程，而且其表達與TNM分期更高、中高分化及存在淋巴結轉移和遠期轉移有關，與其他特征無關，提示LncRNA-MAFG-AS1參與了結直腸癌的發展和轉移；K-M生存分析顯示高表達LncRNA-MAFG-AS1患者的總生存時間及無進展生存時間均較低表達者明顯減少，表明LncRNA-MAFG-AS1與結直腸癌患者預后密切相關；接下來的Cox多因素回歸模型分析提示LncRNA-MAFG-AS1是結直腸癌患者的預后不良的影響因素，更加表明LncRNA-MAFG-AS1與結直腸癌預后密不可分；但其具體的分子機制仍需進一步的深入研究。

LncRNA-MAFG-AS1在結直腸癌組織中呈高表達，且與結直腸癌患者的TNM分期、分化程度及淋巴結和遠期轉移有關，是結直腸癌患者預后獨立影響因素。但其具體作用機制需進行更深入地細胞學研究。同時，本研究患者只選自了河北醫科大學第二醫院，可能存在選擇性偏倚；且本研究中患者的時間區間較寬，隨訪時間較長，可能會對結果產生一定的影響；以上的結論還需要大樣本、多中心進一步研究證實，為臨床醫生提供更真實準確的治療信息。

綜上所述，LncRNA-MAFG-AS1在結直腸癌組織中呈高表達，且與結直腸癌患者分化程度、TNM分期、淋巴結和遠期轉移有關，是影響結直腸癌患者預后的獨立風險因素。