COPD中MicRNA-320c-5p調節SERPINA1基因表達的研究

任 杰，祖力皮喀爾·阿卜杜熱合曼，弓 慧，鐘雪梅，鄭愛芳，李 黎

(新疆維吾爾自治區喀什地區第一人民醫院呼吸與危重癥醫學科， 新疆 喀什 844000)

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種原因復雜的異質性疾病[1]。SERPINA1是SERPINA家族成員，是編碼α1-抗胰蛋白酶(alpha-1-antitrypsin，AAT)的關鍵基因,AAT缺乏是與COPD有關的遺傳危險因素[2]。本團隊前期研究發現，SERPINA1基因rs9944155可能與維吾爾族COPD的發病有關，SERPINE2基因rs16865390與喀什地區COPD易感性無明顯相關性。有研究報道，SERPINA1 rs8004738的單核苷酸多態性可增高人群COPD的患病風險[3]。因此，SERPINA1在COPD發生發展中具有重要作用，目前關于COPD中miRNA與SERPINA1相互的靶向調控關系的研究報道較少，其機制尚不完全清楚。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1載體、菌種及細胞 DH5α感受態細胞購自天根公司，293T細胞、人正常肺上皮細胞系(BEAS-2B)購自ATCC公司(貨號CRL-9609)。psiCHECK2載體和Dual-Luciferase報告基因檢測試劑盒購自Promega公司。

1.1.2酶及主要試劑 總RNA提取試劑Trizol、轉染試劑Lipofectamine 3000購自Invitrogen公司；miRNA提取試劑盒(miRNeasy Mini Kit，217004)、miRNA轉錄試劑盒(miScript Ⅱ RT Kit，218161)均購自QIAGEN公司；PCR TAQ酶、連接酶購自TAKARA公司；膠回收和質粒小提試劑盒購自北京天根生物技術有限公司；點突變試劑盒購自NEB公司Site-Directed Mutagenesis Kit。miR-320c-5p模擬物(mimics)由Invitrogen公司設計并合成。高糖DMEM、DMEM/F-12培養液購自Gibco公司，0.25%胰蛋白酶、Opti-MEM和Lipofectamine 3000購自Invitrogen公司；Prime Script RT-PCR Kit和SYBR Premix ExTaq Ⅱ均購自TaKaRa公司。miR-320c-5p mimics及其陰性對照片段NC mimics購自上海吉瑪生物科技公司產品；miRNA特異性引物和定量PCR引物購自上海生工。

1.2方法

1.2.1COPD細胞模型的建立 CSE的制備，方法參照文獻[PRKN-regulated mitophagy and cellular senescence during COPD pathogenesis]。取一支香煙均速從裝有25 mL DMEM注射器中冒出，這種培養液定義為100% 濃度的香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract,CSE)。每次100%CSE需要新鮮制備，并使用DMEM稀釋到最終工作濃度(濃度比10%)，在30 min內使用。正常BEAS-2B當細胞匯合度達到為80%～90% 時，用3% CSE處理24 h，即COPD細胞模型。后續進行基因表達檢測。

1.2.2Realtime RT-PCR檢測目標microRNAs和SERPINA1基因表達 將人正常肺上皮細胞系(BEAS-2B)和COPD細胞培養至48 h收集細胞。使用QIAGEN公司miRNeasy Mini Kit試劑盒提取細胞microRNAs，miScript Ⅱ RT Kit試劑盒進行microRNAs轉錄。Trizol法提取細胞總RNA。紫外分光光度計測定OD230、OD260值后，進行反轉錄。

SERPINA1基因引物，F：5′-GACACCGAAG-AGGCCAAGAA-3′；R:5′-TGGAAGTCCTCTTC-CTCGGT-3′(位置564～745，產物長度182 bp)。MicroRNAs上游檢測引物(F)如下：MiR-26-5p:5′-TTCAAGTAATCCAGGATAGGC-3′，MiR-320c-5p:5′-AAAAGCTGGGTTGAGAGG-3′，MiR-210-5p:5′-AGCCCCTGCCCACCGCAC-3′，MiR-96-3p:5′-AATCATGTGCAGTGCCAATATG-3′。

使用2△△CT法對SERPINA1 mRNA水平的表達進行定量分析。結果分析時，獲得基因的CT值，取基因CT值與β-actin基因濃度值的比值作為基因相對表達量。

1.2.3Luciferase報告基因載體構建 取人正常肺上皮細胞系(BEAS-2B)，使用酚氯仿抽提基因組DNA，設計引物使用TAQ酶進行PCR擴增SERPINA1 基因3′UTR區域，使用Not1和 Xho1雙酶切PCR產物和psiCHECK載體后，T4連接酶進行DNA連接反應，熱激轉化DH5α感受態細胞，挑取陽性克隆提取質粒。陽性質粒標記為SERPINA1-WT。以為SERPINA1 -WT質粒為模板，設計點突變引物，使用NEB公司 Site-Directed Mutagenesis Kit試劑盒按照說明書進行MiR-320c-5p分子靶位點突變，突變后質粒命名為SERPINA1-MT。

SERPINA1 基因3′UTR區域參照NCBI序列(NT_187601)，PCR擴增引物如下，WT-F：5′-ATAACTGCCTCTCGCTCCTCAAC-3′；WT-R:5′-TGCAAGAAATGTAGTTCTA-3′(位置12 184～13 889，產物長度1 705 bp)。點突變有兩對引物，序列如下，MT-F1：5′-ATAACTGCCTCTCGCTCC-TCAAC-3′；MT-R1：5′-GAATCCTCACGATAC-GGACCT-3′(斜體序列為MiR-320c-5p分子靶位點，下劃線為突變位點，原序列為GCT)；MT-F2：5′-AGGTCCGTATCG-TGAGGATTC-3′(斜體序列為MiR-320c-5p分子靶位點，下劃線為突變位點)；MT-R2:5′-TGCAAGAAATGTAGTTCTA-3′。PCR擴增采用如下體系：TaqDNA 聚合酶(2.5 U/μL)0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)2 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，DNA模板2 μL(100 ng)，補水至25 μL；反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，35個循環；72 ℃延伸7 min。

1.2.4細胞轉染 將293T細胞接種于6孔板中，密度為4×105個/孔，用含10% FBS的DMEM培養液培養24 h，細胞融合度達 70%～80%進行后續的轉染。按照說明書溶解miR-195模擬物以及陰性對照NC，濃度為20 μmol/L。在聚丙烯管里準備Lipectamine 3000和DNA復合物：在聚丙烯管中加入0.5 mL預熱的Opti-MEM培養基，加入miR-195模擬物100 nM和SERPINA1-WT的野生型和SERPINA1-MT突變型質粒2 μg，輕輕混勻后室溫放置10 min。在另一個管中加入0.5 mL預熱的Opti-MEM培養基，再加入8 μL Lipectamine 3000。輕輕混勻后室溫放置10 min。將上述稀釋好的DNA與脂質體混合。混合物置于室溫孵育20 min。6 h后，移去脂質體和DNA復合物，在每個培養皿中重新加入2 mL新鮮的培養液，轉染48 h后收集細胞，檢測Luciferase報告基因活性。

1.2.5Luciferase報告基因檢測 選取轉染48 h后293T細胞，用 PBS 沖洗細胞3遍后，加入1×PLB裂解液500 μL，室溫下裂解15 min。4 ℃離心10 min，吸取上清液進行檢測。將100 μL試劑盒中LAR Ⅱ液加入96 孔酶標板中，將20 μL細胞溶解物轉移到含有100 μL LAR Ⅱ液的酶標板中，吹打混勻。在多功能酶標儀上檢測Firefly 熒光素酶讀數。加入100 μL Stop&GloReagent，短暫混勻后測定Renilla熒光素酶讀數。樣品的相對熒光素酶活性即為 Firefly/Renilla 熒光素酶讀數。

1.3統計學方法 應用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析。計量資料比較采用t檢驗，三組間采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.13%CSE細胞中5個miRNA本底表達水平結果 在3%CSE細胞株中提取總RNA，應用 RT-qPCR熒光定量方法分別對MicR-26-5p、MicR-320c-5p、MicR-210-5p、MicR-96-3p進行反轉錄擴增，用U6作為內參，結果顯示MicR-320c-5p及MicR-96-3p的表達量明顯低于其他，表達值分別為0.48、0.45(P<0.05),SERPINA1mrna為 3.41表達上調(P<0.05)，3%CSE中MicR-320c-5p、MicR-26-5p、MicR-210-5p、MicR-96-3p表達均下調，SERPINA1表達上調，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 3%CSE細胞中5個miRNA本底表達水平結果Table 1 Results of background expression levels of five miRNAs in 3% CSE cells

2.2MicR-320c-5p與3′UTR的結合及突變位點 本研究通過生物信息學預測軟件預測MicR-320c-5p和SERPINA1的3′UTR存在互補結合位點，同時構建SERPINA1 3′UTR的突變位點，見表2。

表2 MicR-320c-5p與3′UTR的結合及突變位點Table 2 Binding and mutation sites of MicR-320c-5p and 3′UTR

2.3雙熒光素酶活性結果 為了進一步驗證micR-320c-5p是否調控SERPINA1-3′UTR中的表達，本研究將micR-320c-5p與野生型或突變型SERPINA1-3′UTR結合，然后將雙熒光素酶報告質粒轉染到293T細胞，使用mimic陰性對照作為對照組，檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的發光。結果顯示，micR-320-5p mimic和SERPINA1野生型3′UTR構建體的相對熒光素酶活性明顯下降，和對照組相比差異有統計學意義(P<0.001)，而在SERPINA1突變型3′UTR構建體的相對熒光素酶活性無明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)，結果表明，micR-320c-5p可以直接靶向SERPINA1的3′UTR序列，SERPINA1是miR-320c-5p的直接靶基因。

熒光素酶數值：SERPINA1-WT+NC 100%與SERPINA1-WT+miR-320 mimics 65.63%比較，差異有統計學意義[(100.00±0.17)%vs.(65.63±0.41)%，P<0.001]；SERPINA1-MT+NC 95.21%與SERPINA1-MT+miR-320 mimics 95.81%比較，差異無統計學意義[(95.21±0.23)%vs.(95.81±0.38)%，P>0.05]。

3 討 論

COPD基因多態性與環境因素共同增加疾病發展的風險，其臨床表現和致病機制存在異質性[4]。miRNA(MicroRNA)是18～24 kb大小的非編碼RNA，通過與mRNA的3′UTR結合來調控基因表達，參與細胞增值，細胞周期調控等過程[5]。研究顯示，miRNA在COPD中參與細胞通信，氣道上皮重塑和炎癥免疫等過程[6]。有研究表明，血液中miRNA-320家族表達下調，降低生存率，在COPD中miR-34c表達下調，負調控SERPINE1的表達[7]。抗胰蛋白酶缺乏癥(alpha-1 antitrypsin defificiency，AATd)可由SERPINA1的雙等位基因突變引起，是COPD發病的重要遺傳危險因素，SERPINA1基因突變可增加COPD患病風險，其病理生理作用由表達、調控或轉錄后修飾的差異決定[8]。研究表明，醌氧化還原酶(quinone oxidoreductase)NQO1可結合SERPINA1 3′UTR，NQO1可能與抑制SERPINA1mRNA翻譯的miRNA結合，促進SERPINA1mRNA的翻譯，增強抗胰蛋白酶的表達(novel RNA-binding activity of NQO1 promotes SERPINA1 mRNA translation)[9]。NQO1對SERPINA1mRNA翻譯的影響是否由其他microRNA的相互作用來調節尚不清楚。在TFEB基因轉移后，還檢測到SERPINA1mRNA和單體的顯著減少(autophagy master regulator TFEB inducesclearance of toxic SERPINA1/α-1-antitrypsin polymers)，SERPINA1表達降低是由于SERPINA1聚合物降解增加，進而導致NF-κB活化及白細胞介素6減少，激活的NF-κB和白細胞介素6均能促進SERPINA1的轉錄。肝臟NF-κB活性降低可促進SERPINA1基因表達及肝臟修復。miRNA通過與編碼區或非編碼區(非翻譯區3′UTR和5′UTR)中的靶mRNA序列互補結合來調節基因表達，這些非編碼RNA的表達改變已被證明與COPD發病及預后相關[10]。

既往研究顯示，在COPD患者中miRNA存在差異性表達，部分上調(miR-1246、miR-1258、miR-556-3p、miR-1468-5p、miR-126-5p和miR-130b-5p)部分下調(miR-182-3p、miR-497-5p和miR-492)[11]。本研究發現，在3%CSE細胞中micR-320c-5p、micR-96-3p、micR-210-5p及micR-26-5p表達均降低(P<0.01)，有研究顯示，miR-210在COPD患者血漿中上調，可作為COPD的早期診斷標志物[12]，本研究結果與之存在差異，同類研究顯示micR-320b在COPD存活和非存活患者之間存在明顯差異性高表達，與生存周期呈正相關，且在白細胞中表達，參與免疫調節，抑制與COPD相關的癌癥的發展[13]，本研究結果與之相符。

SERPINA1在呼吸系統疾病中的影響表現各異，依賴于其表達調控作用。本研究顯示，在3%CSE細胞中SERPINA1 mRNA呈現高表達。SERPINA1基因的SNPrs8004738與中國人群中患COPD的高風險相關，而關于SERPINA1與COPD的相關研究較少。動物實驗研究表明，SERPINA1 mRNA可增加體內肺臟及肝臟SERPINA1蛋白的含量[14]，與本研究SERPINA1 mRNA在3%CSE細胞中表達量上調結果相符，進一步佐證了SERPINA1 mRNA影響COPD的表達調控。

既往研究顯示，在肺囊性纖維化等相關肺部疾病中microRNAs可以結合同源序列來抑制靶向SERPINA1(A1AT編碼基因)mRNA的miRNAs的表達，為靶向治療提供替代策略[15]，而在COPD中缺乏相關研究，SERPINA1的表達上調與miR-320的表達下調是否存在靶向性的關系尚不明確，未見相關報道，本研究結果顯示過表達miR-320-5p后的相對熒光素酶活性明顯下降，而SERPINA1-3′UTR突變后的熒光素酶活性無顯著下降(P>0.05)，結果表明micRNA-320c-5p與SERPINA1的3′UTR序列存在靶向性關系，負調控SERPINA1的表達。

綜上所述，本實驗利用RT-qPCR發現miRNA在3%CSE中低表達，SERPINA1高表達，驗證了micR-320c-5p可負調控SERPINA1的表達，為進一步研究miRNA在COPD中發生發展機制中的作用提供了實驗基礎，提供治療方向。但對MicR-320c-5p如何調節SERPINA1的表達及是否受相應炎癥因子調節通路的影響，有待進一步的探究，目前仍缺乏COPD中miRNA的綜合性研究，可為COPD的治療策略提供新的治療靶點和方向。