附子多糖對深低溫凍存血管保存效果的影響研究

鐘郁佳 史業弘 王成

近年來，隨著血管移植技術和低溫醫學的不斷發展，經深低溫凍存的血管組織在臨床得以應用[1]。目前，臨床上常以滲透性冷凍保護劑二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)保存血管組織。滲透性冷凍保護劑可以進入細胞有效地減輕凍存損傷，但DMSO自身具有一定的細胞毒性，隨著其濃度不斷增加，它對組織及細胞產生的損傷也逐漸加重[2]。因此，最適冷凍保護劑的選擇需要考慮到保護劑的特性和濃度，以此來達到更好的保存效果。目前，冷凍保護劑的發展趨勢是找尋安全無毒的冷凍保護成分代替DMSO等滲透性保護劑。糖類作為非滲透性冷凍保護劑的一種，因其無毒性且具有多種生物特性在深低溫凍存中的作用已被大量研究證實[3-5]。程晨晨等[6]通過觀察不同冷凍保護劑對液氮深低溫凍存同種帶瓣大動脈的研究結果顯示，海藻糖對深低溫保存同種帶瓣大動脈活性的效果優于使用DMSO，可有效抑制組織細胞凋亡發揮對血管的保護作用。目前，將中藥多糖，如紅景天多糖、枸杞多糖等作為冷凍保護劑應用于深低溫保存的相關研究也逐漸開展[7-8]。

附子多糖(fuzi-polysaccharides，FPS)是從中藥附子中提取的葡聚糖，無明顯毒性，且具有抗氧化應激、清除自由基，保護血管平滑肌細胞等作用[9]。但附子多糖能否作為冷凍保護劑發揮對深低溫凍存血管的保護作用目前尚未見相關報道。本研究將FPS應用于經深低溫凍存的SD大鼠腹主動脈，探討其能否在深低溫環境中通過抑制線粒體凋亡通路發揮對血管的保護作用，并探尋FPS的最適濃度。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠36只，8周齡，體質量為(200±20)g，購于長沙市天勤生物技術有限公司(實驗動物生產許可證號：SCXK(湘)2019-0014)。所有大鼠適應性喂養1周，保持12小時的光/暗周期，自由活動進食和飲水。本實驗經遵義醫科大學實驗動物倫理委員會批準，編號：倫審(2021)2021ZH0091。

1.2 實驗試劑與儀器

附子多糖(批號：U-F-FZTQW20200825)，購自陜西昂盛生物醫藥科技有限公司。精準稱量附子多糖粉劑1 mg、10 mg、100 mg、200 mg，各自溶于10 mL滅菌注射用水中，充分攪拌使其溶解，用濾膜過濾至10 mL離心管中，配制成濃度0.1 mg/mL、1 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的附子多糖冷凍保護劑，4℃冰箱冷藏保存。

4%多聚甲醛固定液(批號：E672002-0500)、蘇木素伊紅染色試劑盒(批號：E607318)，購自上海生工生物技術公司；RIPA裂解液(批號：P0013E)、組織線粒體分離試劑盒(批號：C3606)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號：P0012)、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒(批號：P0012A)均購自中國碧云天生物科技公司；兔抗Bcl-2(批號：ab182858)、Bax(批號：ab32503)、Cyt-c(批號：ab133504)、Caspase-9(批號：ab32539)，購自Abcam公司；兔抗GAPDH(批號：KGAA002)、山羊抗兔二抗(批號：KGAA35)購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；Bcl-2、Bax、GAPDH引物由上海生工合成；RNA提取試劑盒(批號：9767)、反轉錄試劑盒(批號：RR047A)、SYBR Premix Ex TaqⅡ(批號：RR820A)均購自日本Takara公司。

全自動組織切片機(德國萊卡公司，型號：RM2235)；光學顯微鏡(日本Olympus公司，型號：BX43)；超微量分光光度計(美國Thermo公司，型號：NanoDrop2000)；熒光定量PCR儀(美國安捷倫科技公司，型號：Mx3000P)；轉印電泳儀(北京六一生物科技有限公司，型號：DYCZ-40K)；臺式高速冷凍離心機(美國sigma公司，型號：3K15)。

1.3 動物分組與處理

將36只大鼠隨機分為對照組(未做任何處理)、凍存模型組(滅菌注射用水)、FPS 0.1 mg/mL組、FPS 1 mg/mL組、FPS 10 mg/mL組和FPS 20 mg/mL組。空氣栓塞法處死大鼠后，無菌環境下游離腹主動脈，生理鹽水洗去殘血，修剪周圍多余脂肪、結締組織。將凍存模型組和FPS濃度組分別置于對應溶液的凍存管中，經4℃平衡20分鐘后放入程序降溫盒梯度降溫至-80℃過夜，次日放入液氮中保存，1周后取出凍存管于37℃水浴中快速復溫進行指標檢測。對照組取材后直接進行檢測。

1.4 指標檢測

1.4.1 蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色 4%多聚甲醛固定24小時后脫水、包埋、切片(0.3 μm)。60℃烤片1小時，二甲苯及梯度酒精脫蠟，蘇木素染色，鹽酸酒精分化，伊紅染色，逆梯度酒精及二甲苯脫水，樹脂封片。光學顯微鏡下400倍觀察腹主動脈各層結構完整性。

1.4.2 蛋白免疫印跡法(western blot，WB)檢測 B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、細胞色素c(cytochrome c，Cyt-c)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(cysteinE-dependent aspartatE-specifc proteases-9，Caspase-9)蛋白表達腹主動脈剪切成細小的碎片放入1.5 mL滅菌干燥EP管中，一次性研磨棒充分研磨，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀。加入裂解液提取總蛋白和胞漿蛋白，胞漿蛋白提取時需加入組織線粒體分離試劑，Cyt-c使用胞漿蛋白，Bcl-2、Bax、Caspase-9使用總蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度；配制SDS-PAGE分離膠和濃縮膠，放入電泳槽內；取適量蛋白質樣品與5×上樣緩沖液4∶1混勻，于沸水中處理使蛋白變性；上樣，電泳；將目的蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶搖床封閉2小時，TBST溶液洗膜3次，每次5分鐘，分別加入稀釋的Bcl-2、Bax、Cyt-c、Caspase-9、GAPDH一抗中，4℃孵育過夜。次日室溫孵育復溫，TBST溶液洗膜3次，每次10分鐘；加入羊抗兔二抗工作液(1∶1500稀釋)內，室溫孵育1小時，TBST溶液洗膜洗膜3次，每次10分鐘；最后采用ECL發光試劑盒顯影。Image J分析條帶的吸光度值，計算蛋白相對內參GAPDH的表達量。

1.4.3 實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)腹主動脈中Bcl-2、Bax mRNA表達 取大鼠腹主動脈50 mg，按動物組織總RNA提取試劑盒說明書方法進行總RNA提取。采用紫外—可見分光光度計測定RNA的濃度和純度，取光密度比值OD260/OD280值最好在1.9～2.0之間的樣品，根據試劑盒說明書進行操作，在基因擴增儀中(37℃孵育15分鐘；85℃孵育5秒)逆轉錄得到cDNA。以cDNA為模板采用兩步法進行PCR擴增。反應體系(共20 μL)包括2× TB Green Premix Ex Taq II 10 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物各0.8 μL，RNasE-free ddHO 6.4 μL。反應條件為95℃預變性30秒；95℃退火5秒，60℃延伸30秒，共40個循環。GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算各組大鼠腹主動脈中Bcl-2、Bax mRNA表達水平。引物由生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 附子多糖對深低溫凍存大鼠血管組織病理形態的影響

光鏡下，與對照組相比，凍存模型組內膜斷裂，中膜結構層次紊亂，平滑肌細胞排列疏松，空泡樣改變嚴重，細胞核數目明顯減少，胞質染色淺，外膜結構消失。說明深低溫凍存過程破壞了血管組織結構的完整性；與凍存模型組相比，FPS 0.1 mg/mL組表現類似，可見內皮細胞大面積脫失，內彈力膜斷裂不連續，平滑肌細胞排列疏松，空泡樣改變嚴重，細胞核數目明顯減少，胞質染色淺；從FPS濃度1 mg/mL起，血管組織內膜連續性開始增強，中膜層纖維組織排列相對緊密，外膜可見；FPS 10 mg/mL組、FPS 20 mg/mL組膜結構保存與對照組相似，內皮細胞連續排列，內彈性膜完整，平滑肌細胞緊密排列，細胞核呈桿狀，胞質粉紅色，組織結構保存相對完整。見表2、圖1。

注：A為對照組；B為凍存模型組；C為FPS 0.1 mg/mL組；D為FPS 1 mg/mL組；E為FPS 10 mg/mL組；F為FPS 20 mg/mL組。

表2 各組深低溫凍存大鼠血管組織病理形態學比較鼠只=6)

2.2 附子多糖對深低溫凍存大鼠血管組織Bcl-2、Bax、Cyt-c、Caspase-9蛋白表達的影響

與對照組比較，凍存模型組Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，Bax、Cyt-c、Caspase-9蛋白表達水平均顯著增加(P<0.05)。與凍存模型組比較，不同濃度FPS組Bcl-2蛋白表達均明顯增加(P<0.05)；FPS 0.1 mg/mL組Bax、Cyt-c、Caspase-9蛋白表達無顯著差異(P>0.05)，其余各濃度組Bax、Cyt-c、Caspase-9蛋白表達明顯降低(P<0.05)；與FPS 0.1 mg/mL、FPS 1 mg/mL組相比較，高劑量組(FPS 10 mg/mL、FPS 20 mg/mL)可以顯著上調Bcl-2蛋白表達水平(P<0.05)，下調Bax、Cyt-c、Caspase-9蛋白表達水平(P<0.05)，且FPS 10 mg/mL時，對促凋亡因子蛋白表達的抑制和抗凋亡因子蛋白表達的促進基本達到飽和。見圖2、表3。

表3 各組大鼠血管組織Bcl-2、Bax、Cyt-c、Caspase-9蛋白表達水平比較鼠只=6)

注：A為對照組；B為凍存模型組；C為FPS 0.1 mg/mL組;D為FPS 1 mg/mL組;E為FPS 10 mg/mL組;F為FPS 20 mg/mL組

2.3 附子多糖對深低溫凍存大鼠血管組織Bcl-2、Bax mRNA表達的影響

與對照組比較，凍存模型組Bcl-2 mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)，Bax mRNA表達水平均顯明增加(P<0.05)。與凍存模型組比較，不同濃度FPS組Bax mRNA表達均明顯降低(P<0.05)；除FPS 0.1 mg/mL組外，其余FPS濃度組Bcl-2 mRNA表達均增加(P<0.05)；各濃度FPS組相比，FPS 10 mg/mL組可以顯著上調Bcl-2 mRNA表達水平，下調Bax mRNA表達水平。見表4。

表4 各組大鼠血管組織Bcl-2、Bax mRNA表達水平比較鼠只=6)

3 討論

學術界普遍認同深低溫凍存技術可以長期保存生物器官組織活性[10]。低溫生物學研究證實，細胞的活躍程度在低溫的周圍環境中逐漸下降，各種酶活性也會相應下降。在深低溫環境(-196℃液氮)中，理論上所有生物活動都會停止。此時，細胞既不會凋亡，也不會壞死，故組織細胞的生命活性得以保存[11]。待需要使用時，給予一定條件復溫后組織細胞可以恢復其活性，發揮功能。然而，冷凍和解凍過程都會對細胞、組織造成一定損傷[12]。在冷凍過程中，由于各種外界刺激的影響可促使細胞內發生一系列的級聯反應，從而發生凋亡[13]。研究發現，低溫損傷導致的凋亡更多是通過線粒體介導的[14]。線粒體對低溫很敏感，強烈的低溫刺激造成線粒體功能障礙，從而導致自噬、凋亡、壞死等下游事件的發生。Bcl-2家族是線粒體凋亡途徑的主要調節因子，其中以Bcl-2為代表的抗凋亡蛋白和Bax為代表的促凋亡蛋白間的相互抗衡和相互作用決定著細胞的生存或死亡[15]。兩者通過穩定細胞膜完整性和抑制線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeablity transition pore，MPTP)的開放來阻止Cyt-c從線粒體釋放。而Cyt-c可以通過結合凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)和Caspase-9前體形成凋亡小體，從而激活凋亡執行者半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteinE-dependent aspartatE-specifc proteases-3，CaspasE-3)誘導細胞凋亡[16]。

中醫學認為中藥附子有回陽救逆、補火助陽、溫陽散寒止痛的功效[17]。深低溫保存具有陰寒之環境，根據中醫“陰陽”辨證關系，性大熱的附子有可能對抗深低溫之寒冷。本研究發現，凍存模型組大鼠腹主動脈損傷高于對照組，說明低溫環境可以導致血管組織細胞損傷。而FPS作為冷凍保護劑時有較好的保護效果，結果顯示，添加一定濃度的FPS有利于保存血管結構的完整性，其中較高濃度的FPS(FPS 10 mg/mL組、FPS 20 mg/mg組)內皮細胞、內彈力膜及平滑肌細胞結構保存明顯優于其余各組，能較好的保持大鼠腹主動脈正常結構。

為進一步探討FPS抑制低溫損害導致凋亡的可能機制，本研究對Bcl-2/Bax-Cyt-c-Caspase-9信號途徑進行了檢測。結果表明，當血管組織經深低溫凍存后，Bcl-2和Bax比例平衡被打破，導致線粒體通透性增加，Cyt-c從線粒體內膜釋放，進一步激活Caspase-9，誘發凋亡。本研究結果中，蛋白表達與mRNA表達結果不一致。一方面，可能因為低溫對RNA和蛋白等生物大分子具有不同程度的影響[18]；另一方面，基因經轉錄、翻譯成蛋白質后，還需進行磷酸化、糖基化等修飾，因而會存在蛋白質與基因表達并不完全一致[19-20]。而蛋白質作為生理功能的執行者，更能夠直觀反映出基因的表達水平。研究發現，只有達到一定濃度的FPS才能起到抑制凍存所致血管組織細胞凋亡的作用，不同濃度的FPS對凋亡的影響并不一致。根據實驗結果，我們得出濃度為1 mg/mL的FPS是對深低溫凍存血管組織產生保護作用的起始濃度；FPS濃度為10 mg/mL時對促凋亡因子的抑制和抗凋亡因子的促進基本達到飽和，FPS濃度為10 mg/mL和20 mg/mL時能最大限度地抑制線粒體凋亡通路中相關基因的表達，兩者效果相近，但FPS 10 mg/mL組即在藥物用量相對較少的情況下就能產生對深低溫凍存血管的保護作用，故濃度為10 mg/mL時可能是FPS作為冷凍保護劑的最適濃度。

綜上所述，本研究通過光鏡、WB和qRT-PCR證實FPS可以減輕深低溫凍存血管組織的凍存損傷，其作用機制可能與其通過對線粒體凋亡通路相關基因的調控，抑制細胞凋亡，從而起到對血管組織的保護作用有關。然而鑒于細胞凋亡途徑的多樣性以及是否還涉及其他相關基因，后續的研究還需在此方面做出進一步探索。