響應面優化提取莧菜紅色素及其穩定性研究*

聞玉慧，王鑫蒙，艾春辛，趙文靜，石 彬，張 偉，郭 嬌

(1 新鄉學院化學與材料工程學院，河南 新鄉 453003；2 新鄉市博源科技有限公司，河南 新鄉 453003)

莧菜為一年生草本莧科屬植物，其含有大量的天然紅色素，在我國各地普遍種植，莖粗壯，成紫紅色，耐旱、濕和高溫[1]，性味甘涼，清熱解毒，利便明目[2]。莧菜紅色素無毒、性質穩定、色澤明艷、水溶性好。由于莧菜生長迅速，管理方便，每年可摘三茬，產量高，價格便宜[3]。所以對天然紅色素的提取和開發有著廣闊的發展前景。

目前，對莧菜紅色素的提取研究不多，一般的方法是水浸提法，如高英[4]用乙醇做浸提劑，張萃明[5]用水、NaOH溶液提取，尹琳琳[6]用超高壓提取等。這些方法提取的莧菜紅色素純度不高，色澤不好，且耗能、耗時、提取率低[7]。本文采用超聲波輔助提取莧菜紅色素，確定了莧菜紅色素的最佳工藝條件，并分析了其在各種條件下的穩定性，為天然莧菜紅色素的提取和儲存使用提供了技術參考。

1 莧菜紅色素的提取實驗

1.1 材料、試劑與儀器

莧菜，市售。

無水乙醇，天津市德恩化學試劑有限公司；濃鹽酸，揚州市華富化工有限公司；過氧化氫，廣東光華科技股份有限公司；亞硫酸鈉，天津市興復精細化工研究所；氯化銨、無水氯化鈣、氯化鋇、氯化鉀氯化鈉，天津市天力化學試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

0.2 μm水系微孔過濾膜，天津市津騰實驗設備有限公司；定性濾紙，杭州特種紙業有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計，北京普析儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 莧菜的處理

將新鮮莧菜清洗干凈之后，放入電熱鼓風干燥箱中干燥，用粉碎機將莧菜粉碎后，將粉末在99.9%的乙醇中浸泡一天去除綠色素，然后再在干燥箱中烘干，過40目的篩子待用。用UV-1600紫外可見分光光度計，對莧菜粉末進行定容稀釋后的色素溶液，進行全波長掃描，確定色素的最大吸收波長。

1.2.2 超聲波提取莧菜紅色素

準確稱取1.00 g莧菜粉末于燒杯中，加入蒸餾水30 mL分別在20、35、50、65和80 ℃條件下，用超聲波儀器提取30 min。在料液比(mL/g)10∶1、20∶1、30∶1、40∶1和50∶1的情況下，在超聲波中提取30 min，30 ℃條件下超聲提取20、30、40、50和60 min，用0.2 μm微孔濾膜過濾后，將得到的濾液稀釋同樣倍數到同樣大小的比色管中，在最大吸收波長處測定各個樣品的吸光度值。在單因素實驗的基礎上，以超聲波的提取溫度、料液比、提取時間為因素，以吸光度值為響應值，確定最優條件。

表1 莧菜紅色素的影響因素與水平

1.2.3 不同條件下超聲波提取對莧菜紅色素的穩定性研究。

設置不同梯度的超聲溫度(20、30、40、50、60、70、80 ℃)，pH為(1、3、5、7、9、11、13)，金屬離子(Ba2+、Na+、Ca2+、NH4+、K+)和不同光照時間(6、12、18、24 h)、不同濃度氧化劑H2O2(1%、2%、3%、6%和15%)、不同濃度的還原劑Na2SO3(0.01 mol/L、0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.3 mol/L和0.5 mol/L)。

1.2.4 響應面優化分析法

本次實驗使用Design-Expert 10軟件中的響應面設計法，以吸收波長為響應值，設計超聲提取時間、溫度、料液比3因素3水平的實驗方案。根據實驗結果擬合得出的數學模型，確定最佳提取條件。

1.3 莧菜紅色素的提取結果與分析

1.3.1 莧菜紅色素最大的吸收波長確定

如圖1所示，最大吸收峰在(520～540 nm)范圍內，波長在531 nm處有最大值，與查閱的張萃明[5]文獻波長λ=535 nm雖有差別，但差別不大，或許是因為莧菜的品種不同，也可能是儀器的誤差，所以此次實驗采用531 nm為莧菜紅色素的最大吸收波長。

圖1 莧菜紅色素全波長圖

1.3.2 不同溫度對莧菜紅色素的提取結果影響

由圖2知，在20～50 ℃范圍內，莧菜紅色素的吸光度值隨著溫度的升高而增大，在折線圖上可以清晰的看見50 ℃時數值大，色素提取最好，50～80 ℃之間時，溫度升高吸光度值降低了，并且溫度升高時提取的莧菜色素不再是紫紅色，而是棕黃色，溫度越高棕黃色越深，可能是溫度升高對色素的細胞結構造成損壞，使得色素的吸光度值降低，從而降低了色素的提取率。

1.3.3 不同料液比對莧菜紅色素的提取效果影響

由圖3可知，料液比在10～40 mL/g之間時，折線圖中橫坐標比值增大，吸光度值也增大，在折線圖上40∶1(mL/g)時吸光度值最大，料液比高于40 mL/g之后，增大的料液比并不會使吸光度值增加，說明此條件下莧菜紅色素已經不再能析出。故最優料液比為40∶1(mL/g)。

圖3 不同料液比對莧菜色素吸光度值的影響

圖4 不同提取時間對莧菜色素吸光度值的影響

1.3.4 不同提取時間對莧菜紅色素的提取效果影響

由圖 4知，提取時間在20～40 min內時，折線圖中吸光度值在不斷上升，在折線圖中可以看到40 min時，吸光度值最大，40 min后吸光度值在緩慢降低，故選用40 min較為合適。

1.4 響應面分析試驗

1.4.1 試驗方案及結果

運用Design-Expert 10軟件對表2中數據進行回歸線方程擬合之后，得到莧菜紅色素吸光度值提取溫度A，料液比B，提取時間C的回歸模型，回歸方程為：

表2 莧菜紅色素的Box-Behnken實驗方案

Y=+0.78-0.034A-0.000 075B-0.006 775-0.000 25AB+0.000AC-0.000BC-0.039A2-0.018B2-0.011C2

對上述回歸方程進行方差分析，得到結果見表3。

表3 響應面模擬結果

由表3可以看出，模型模擬得出P值<0.000 1，效果顯著，失擬項的P值>0.05，不顯著，說明了本次建立的模型模擬極顯著，較好的擬合出來超聲波技術提取莧菜紅色素需要的條件，可以用這個方程對實驗結果進行闡述。從表3知，提取溫度、提取時間對莧菜色素的提取影響極顯著(P<0.01)。

1.4.2 響應面分析

超聲提取時間、液料比和提取溫度交互作用對莧菜紅色素提取率影響的響應面曲線及等高線見圖5。

圖5 各因素交互作用莧菜紅色素提取率影響的響應面和等高線

由圖5三因素交互作用的曲面圖可以看出，當提取時間固定，隨著提取溫度與料液比的增大，莧菜紅色素的吸光度值是先增大后減小的，提取溫度在47～49 ℃，料液比在35～45 mL/g內響應面凸起，等高線閉合，說明提取溫度與料液比交互作用有最大值；料液比固定，提取溫度與提取時間的增大，也使紅色素的吸光度值增大，當溫度在47～49 ℃，時間在35～45 min時，曲面有頂點，說明了提取溫度與提取時間交互有最大值，當提取溫度固定時，料液比與提取時間的交互曲面平緩，料液比與提取時間交互不明顯。

利用Design-Expert 10軟件對實驗數據進行回歸方程分析，確定最佳提取條件為提取溫度48.418 ℃，料液比39.408(mL/g)，提取時間34.826 min。此時模擬得到的最高數值為0.790。為驗證模擬結果的真實性，在實驗條件為提取溫度48 ℃，料液比40(mL/g)，提取了35 min，進行10次實驗，測出提取出的莧菜色素吸光度值平均值為0.793，與預測值十分接近，說明響應面優化超聲波提取技術的工藝參數可靠性。

2 結 論

本實驗以新鮮莧菜為研究對象，利用紫外可見分光光度計進行全波長掃描，確定了莧菜紅色素的最高吸收峰的波長為531 nm。利用單因素實驗與響應面優化法相結合的實驗方法，確定了采用蒸餾水為溶劑超聲波輔助提取莧菜紅色素的最佳工藝參數為：提取溫度48 ℃，料液比40∶1(mL/g)，提取時間35 min。通過對超聲波技術提取莧菜紅色素的穩定性分析，發現莧菜紅色素對金屬離子、光照并不敏感，在保存或使用過程中不必考慮金屬離子或光照對它的影響。但是莧菜紅色素對于較高的溫度、強酸、強堿、氧化劑、還原劑較敏感，使用過程中應避免與它們的接觸，以防它們使色素變質，對使用造成影響。