正紅菇多酚的提取及抗氧化性能研究*

李科鵬，馮玉會，普開仙，李銳揚，戴應淑，師 偉，李 琛

(1 玉溪師范學院化學生物與環境學院，云南 玉溪 653100；2 玉溪師范學院物理與電子工程學院，云南 玉溪 653100)

正紅菇(Russulavinosalinolbl)又名大紅菇、紅椎菌，為天然野生高等真菌，隸屬于擔子菌門，傘菌亞門，層菌綱，傘菌目，紅菇科，紅菇屬，紅菇屬種類繁多，目前世界發現約有750種，中國發現約有158種，部分可以食用[1-2]。正紅菇具有降低血糖、調節血脂、治療貧血、抗腫瘤、抗炎、保肝等藥理功能[2-4]，含有蛋白質、多糖、脂肪酸、甾醇、萜類、有機酸、多酚、色素等多種生理活性成分[5-8]，其中多酚具有清除自由基即抗氧化的能力。本文采用超聲波輔助法提取正紅菇中的多酚，通過DPPH自由基清除實驗研究正紅菇多酚的抗氧化活性，為進一步開發利用該食用菌資源提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

野生正紅菇，產自福建；無水乙醇(AR)，國藥集團化學試劑有限公司；超純水，實驗室自制；碳酸鈉(AR)，四川西隴化工有限公司；3,4,5-三羥基苯甲酸(沒食子酸)(AR)，上海安譜實驗科技股份有限公司；福林酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(AR)，合肥博美生物科技有限責任公司。

1.2 供試儀器

DFY-500C搖擺式高速粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司；TG16-WS臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；JJ224BC電子分析天平，常熟市雙杰測試儀器廠；SK3200HP功率可調臺式超聲波清洗器，上海科導超聲儀器有限公司；UV-2700紫外可見分光光度計，島津企業管理(中國)有限公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；OSB-2100水油兩用浴鍋，上海安亭科學儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 沒食子酸標準曲線的繪制

分別量取質量濃度為100 μg·L-1的沒食子酸標準溶液0.00、0.15、0.35、0.55、0.75、0.95、1.15、1.35 mL于25 mL比色管中，加入15.00 mL的超純水，0.30 mL的福林酚溶液，室溫暗處靜置10 min，再加入2.00 mL碳酸鈉溶液，轉移至25 mL容量瓶，定容，搖勻后避光靜置1.0 h，于波長760 nm處測其吸光度。以吸光度為縱坐標，沒食子酸濃度為橫坐標，繪制標準曲線[9]。

1.3.2 正紅菇多酚含量的測定

將野生正紅菇干燥樣品，烘干、粉碎、過60目篩，密封保存，備用。在液料比20∶1、乙醇體積分數50%、超聲溫度40 ℃的條件下超聲40 min得到提取液，分別探究液料比、乙醇體積分數、超聲溫度和超聲時間對正紅菇多酚含量的影響。準確移取提取液1.00 mL作為待測樣品，按1.3.1進行吸光度的測定，根據標準曲線可求得正紅菇多酚含量[10]，具體計算見公式(1)。

(1)

式中：C為正紅菇提取液中多酚的含量，mg/mL；V為所測溶液總體積，mL；N為稀釋倍數；m為正紅菇粉末質量，g。

1.3.3 響應面優化實驗

在單因素實驗基礎上，利用Design-Expert 8.0軟件進行響應面優化設計，以多酚提取量為響應值，以液料比(A)、乙醇體積分數(B)、超聲溫度(C)、超聲時間(D)為因變量，設計四因素三水平響應面分析實驗[8]，對正紅菇多酚提取條件進行優化。

1.3.4 DPPH抗氧化實驗

精確稱取DPPH粉末0.004 0 g，定容至100 mL棕色容量瓶中，避光保存。取2.00 mL不同質量濃度的正紅菇多酚提取液，加入3.00 mL DPPH溶液，搖勻，置于暗處30 min，于517 nm的波長處測定該溶液的吸光度A1；將DPPH溶液用無水乙醇替代，同法操作，吸光度為A2；步驟同A1，將多酚提取液用無水乙醇替代，測吸光度A0，平行測定3次取平均值，按公式(2)進行DPPH自由基清除率的計算[10]。

(2)

2 結果與討論

2.1 沒食子酸標準曲線測定結果

圖1 沒食子酸標準曲線

以吸光度為縱坐標(y)，沒食子酸濃度為橫坐標(x)，繪制標準曲線，求得線性回歸方程為：y=77.513x+0.009 3，R2=0.999 1。可以看出，在沒食子酸濃度為0～0.006 4 mg/mL范圍內，此標準曲線相關度高，可以用于多酚含量的計算。

2.2 單因素實驗測定結果

2.2.1 液料比對正紅菇多酚提取量的影響

如圖2所示，正紅菇多酚提取量隨著液料比的增大先升高后基本保持不變，在液料比35∶1時，多酚提取量最高。原因可能是由于正紅菇粉末與無水乙醇的接觸面積隨著液料比的升高而增大，使多酚物質的浸出效率提高，當液料比達到35∶1時，多酚基本完全浸出；但再加入溶劑會使某些難溶的物質被提取出來，對多酚的提取造成干擾[11]，同時溶劑用量過多也會造成資源的浪費。因此，選擇液料比35∶1較為合適。

圖2 液料比對正紅菇多酚提取量的影響

2.2.2 乙醇體積分數對正紅菇多酚提取量的影響

如圖3所示，正紅菇多酚提取量隨著乙醇體積分數的增大先升高后降低，當乙醇體積分數達到60%時，多酚提取量最高。這可能與正紅菇多酚的親疏水性有關，多酚是一類極性范圍很廣的化合物[12]，乙醇與多酚的極性越接近，多酚提取量越大，乙醇與多酚的極性差距越懸殊，越不利于多酚物質的浸出[13]，60%的乙醇濃度可能與正紅菇多酚的極性較為接近。因此，選擇乙醇體積分數60%較為合適。

圖3 乙醇體積分數對正紅菇多酚提取量的影響

2.2.3 超聲時間對正紅菇多酚提取量的影響

如圖4所示，正紅菇多酚提取量隨著超聲時間的增加先升高后降低，在超聲時間達到60 min時，多酚提取量最高。原因可能是隨著超聲時間的增加，細胞破壁率提高、物質傳遞速率增大，使多酚物質的浸出效率提高，在60 min時，多酚基本完全浸出；再提高超聲時間，空氣中的氧氣會將提取出的多酚物質氧化[14]，使多酚提取量降低。因此，選擇超聲時間60 min較為合適。

圖4 超聲時間對正紅菇多酚提取量的影響

2.2.4 超聲溫度對正紅菇多酚提取量的影響

如圖5所示，正紅菇多酚提取量隨著超聲溫度的增加先升高后降低，當超聲溫度達到50 ℃時，多酚提取量最高。原因可能是溫度升高一定程度上有利于物質的傳遞，但溫度過高，會導致多酚的結構被破壞甚至降解[15]。因此，選擇超聲溫度50 ℃較為合適。

圖5 超聲溫度對正紅菇多酚提取量的影響

2.3 響應面實驗結果分析

2.3.1 響應面實驗設計

利用Box-Behnken進行響應面實驗設計，實驗因素水平見表1，響應面實驗設計及結果見表2。

表1 因素水平

表2 響應面實驗設計及結果

采用響應面軟件對表2實驗數據進行擬合分析，所得模型方程為：正紅菇多酚提取量=3.53+0.079A-0.013B+0.037C+0.046D+4.175E-003AB+0.046AC-0.020AD-0.027BC-0.048BD+0.014CD-0.33A2-0.18B2-0.12C2-0.24D2

2.3.2 響應面方差分析

表3 回歸模型方程的方差分析

2.3.3 各因素交互作用

響應面坡面的傾斜程度越大，提取量受該因素交互作用的影響就越強；反之越平緩，影響就越弱[16]。等高線呈圓形，說明各因素的交互作用較弱；呈橢圓形或馬鞍形，說明交互作用較強[15-16]。各因素中，B與D的交互作用對多酚提取量的影響最強，如圖6所示。但BD的P=0.097 8>0.05，說明其交互作用對多酚提取量的影響不顯著，與2.3.2的結論相一致。同時，響應面開口朝下，說明正紅菇多酚提取量隨著各因素的增大先升高后降低，并具有最大值[9]，與2.2的分析相一致。

圖6 乙醇體積分數和超聲溫度的交互作用對正紅菇多酚提取量的影響

2.3.4 最佳提取工藝的確定及驗證

通過單因素和響應面實驗可知，正紅菇多酚的最佳提取工藝為：液料比35.64∶1、乙醇體積分數59.36%、超聲時間61.89 min、超聲溫度51.03 ℃，此時正紅菇多酚提取量為3.536 7 mg/g。按實際實驗條件修正為：液料比36∶1、乙醇體積分數59%、超聲時間62 min、超聲溫度51 ℃，以修正后的條件進行3組平行實驗，得到正紅菇多酚提取量為3.575 0 mg/g，與理論值接近，表明該模型擬合良好，該工藝切實可行，具有實際應用價值。

2.4 DPPH抗氧化活性分析

如圖7所示，正紅菇中多酚提取物清除DPPH自由基的能力隨質量濃度的升高而逐漸增大，當其濃度超過0.800 0 μg/mL時，清除效果趨于平緩。經線性擬合，正紅菇多酚對DPPH自由基的IC50值為0.243 8 μg/mL，說明正紅菇中多酚具有較好的抗氧化活性。

圖7 正紅菇多酚提取物對DPPH自由基的清除能力

3 結 論

本實驗采用超聲波輔助法從正紅菇中提取多酚類物質，并通過單因素和響應面實驗確定正紅菇多酚最佳提取工藝為：液料比36∶1、乙醇體積分數59%、超聲時間62 min、超聲溫度51 ℃，此時正紅菇多酚提取量為3.575 0 mg/g。根據響應面分析結果，各因素對正紅菇多酚提取量的影響依次為：液料比>超聲溫度>超聲時間>乙醇體積分數。在DPPH自由基抗氧化活性實驗中，正紅菇多酚對DPPH自由基具有較強的清除能力，其IC50值為0.243 8 μg/mL，表明正紅菇多酚具有較好的抗氧化能力，為正紅菇的開發利用提供理論參考。