吉法酯通過調控P38MAPK 信號通路對NSAIDs小腸損傷防治作用的實驗研究

錢瑾，孟立娜

1.杭州師范大學附屬醫院消化內科，浙江杭州 310015；2.浙江中醫藥大學附屬第一醫院消化內科 浙江省消化道疾病病理生理重點實驗室 浙江中醫藥大學消化病研究所，浙江杭州 310006

非甾體類抗炎藥（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）具有解熱、鎮痛及抗炎等作用，目前廣泛用于治療各種慢性疼痛或炎癥，但其不良反應較多，其中以胃腸道損傷為最常見[1-4]。近年來，隨著膠囊內鏡、小腸鏡等內鏡技術的不斷發展，NSAIDs 引起的小腸損傷受到人們的廣泛重視，且缺乏理想的藥物[5]。吉法酯是一種內源性的胃黏膜保護藥，可改善胃黏膜屏障，促進胃黏膜糜爛及潰瘍的修復和愈合，臨床用于防治NSAIDs 相關的胃黏膜損傷，但對NSAIDs 小腸損傷是否也具有防治作用目前報道較少。本研究通過雙氯芬酸短期內給大鼠灌胃建立NSAIDs 急性小腸損傷動物模型，觀察吉法酯對NSAIDs 小腸損傷是否具有防治作用，并探討其可能機制，以期為臨床用藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級、健康、雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠24 只，體質量（240±20）g，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2008-0115，所有動物在造模前自由進食進水，適應環境7d。本實驗獲浙江中醫藥大學實驗動物管理和倫理委員會批準（倫理審批號：ZSLL-2009-072）。

1.2 試劑和藥物

雙氯芬酸緩釋片（北京諾華制藥有限公司）；吉法酯（日本生晃榮養藥品株式會社）；p-P38MAPK多克隆抗體（美國Santa Cruz 公司）；ICAM-1 單克隆抗體（美國BD 公司）；Envision 法免疫組化試劑盒（丹麥DaKo 公司）；羊抗兔二抗HRP、羊抗鼠二抗HRP（美國Santa Cruz 公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組 24 只大鼠采用隨機數字表法分為對照組、雙氯芬酸模型組和吉法酯干預組，每組各8 只。

1.3.2 模型建立 對照組予生理鹽水 10ml/（kg·d）灌胃，雙氯芬酸模型組參照雙氯芬酸人類常規口服治療劑量（75mg/d）折算成大鼠灌胃所需劑量7.8mg/（kg·d）給大鼠灌胃。吉法酯干預組在造模前1d 先予吉法酯31.25mg/（kg·d）灌胃，造模當日起，每天先予吉法酯31.25mg/（kg·d）灌胃，1h 后再予雙氯芬酸7.8mg/（kg·d）灌胃，連續造模5d 后麻醉處死所有大鼠。

1.3.3 標本采集 以3%戊巴比妥鈉0.15ml/100mg腹腔注射麻醉后，打開腹腔，分離腸系膜，沿縱軸剖開全段小腸，用冰生理鹽水沖洗干凈后，將小腸黏膜平鋪于泡沫板上，用大頭針固定，肉眼觀察全段小腸黏膜損傷情況并評分。取病變最明顯處小腸組織，留取一部分小腸組織放入液氮中保存備用，余部分置10%甲醛液中固定24h 后，常規石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色，進行病理損傷評分及免疫組化評分。

1.3.4 小腸組織大體觀察 肉眼觀察大鼠小腸黏膜損傷情況，并按以下標準進行評分[6]：0 分為無損傷；1 分為局部充血、水腫但未出現潰瘍；2 分為有潰瘍，但沒有明顯炎癥；3 分為有潰瘍，僅有一處出現炎癥；4 分為有多處潰瘍和炎癥，潰瘍大小<1cm；5 分為有多處潰瘍和炎癥：至少有一處潰瘍大小>1cm。

1.3.5 小腸組織病理學觀察 大鼠腸道損傷組織學評分標準[7]：0 分為腸黏膜絨毛正常；1 分為絨毛頂端上皮下出現囊狀間隙，并伴有毛細血管充血；2 分為上皮下間隙擴大，中度固有層水腫，中央乳糜管擴張；3 分為固有層明顯水腫，腸黏膜上皮層細胞變性、壞死，少數絨毛頂端脫落；4 分為上皮細胞層變性壞死、脫落，部分絨毛脫落、固有層裸露，毛細血管擴張、充血；5 分為絨毛脫落，固有層崩解，出血或潰瘍形成。每張切片隨機計數20 個視野。

1.3.6 免疫蛋白印跡檢測p-P38MAPK 蛋白的表達應用蛋白提取試劑提取小腸組織總蛋白質，經SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳后轉移到聚偏二氟乙烯膜上，封閉液中室溫封閉2h，加入一抗兔抗大鼠p-P38 多克隆抗體，內參為GAPDH 鼠抗兔單克隆抗體，室溫孵育2h，再加入羊抗鼠IgG-HRP 二抗，室溫孵育1h，最后加入免疫印跡化學發光試劑，壓片顯影。利用BANDSCAN 4.5 進行目的蛋白和內參條帶光密度分析，目的蛋白的表達水平以目的蛋白/內參CAPDH的比值來表示。

1.3.7 免疫組織化學方法檢測細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）的表達采用EnvisionTM兩步法進行免疫組化染色，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。ICAM-1 稀釋濃度為1:50，陽性表達位于細胞膜或細胞質內，為棕黃色或黃色顆粒。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。按細胞著色強度和著色細胞百分比評分：0～1 分為（-），2～3 分為（+），4～5 分為（++），>5 分為（+++）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計軟件對數據進行分析處理。計量資料滿足正態分布且方差齊性，以均數±標準差（）表示，多組間比較用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較用最小極差法（LSD-t法）。等級資料采用非參數秩和檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠小腸損傷情況

2.1.1 小腸黏膜大體損傷評分 各組大鼠無死亡。對照組大鼠小腸黏膜未見明顯損傷，模型組大鼠小腸黏膜均有不同程度的炎癥表現，包括充血水腫、糜爛、出血，腸壁增厚，部分大鼠的小腸黏膜出現潰瘍。其中1 只大鼠出現大量黃色渾濁腹水及腹腔粘連。模型組大體損傷評分顯著高于對照組（P<0.01），吉法酯干預組大鼠腸壁僅見散在輕度充血水腫，部分腸壁可見小潰瘍，病變程度較模型組明顯減輕（P<0.05）。

2.1.2 小腸黏膜病理損傷評分 顯微鏡下觀察，對照組大鼠小腸絨毛結構完整，各層結構清晰無破壞。模型組大鼠小腸黏膜可見大量炎癥細胞浸潤，并出現不同程度的上皮結構消失、絨毛壞死脫落及固有層充血水腫、淋巴管擴張。而吉法酯干預組小腸黏膜病變程度較模型組有所減輕，但部分仍可見淋巴管輕度擴張，伴少量炎癥細胞浸潤。模型組損傷評分顯著高于對照組（P<0.01），吉法酯干預組較模型組減輕（P<0.05），見表1。

表1 各組大鼠小腸大體及組織學損傷評分（，分）

表1 各組大鼠小腸大體及組織學損傷評分（，分）

注：與對照組比較，*P<0.01，#P<0.01；與模型組比較，@P<0.05，&P<0.05

2.2 免疫印跡法檢測大鼠小腸組織p-P38MAPK 蛋白相對表達量

對照組小腸組織中僅檢測到少量p-P38MAPK蛋白的表達，其相對表達量為（0.34±0.14）；模型組的相對表達量（1.73±0.35）顯著高于對照組（P<0.01）。吉法酯干預組的相對表達量（0.87±0.10）較模型組顯著降低（P<0.01）。

2.3 免疫組化法檢測ICAM-1

ICAM-1主要表達于小腸黏膜的上皮細胞、血管內皮細胞及黏膜固有層的炎癥細胞。在模型組中ICAM-1表達顯著高于對照組（P<0.01），而在干預組中ICAM-1表達較模型組明顯減弱（P<0.05）,見圖1。

圖1 大鼠小腸組織ICAM-1 免疫組化（×200）

3 討論

據報道，在長期使用NSAIDs 的患者中，小腸損傷的發生率為50%[1]。NSAIDs 引起的小腸損傷在臨床上可出現消化道出血、蛋白質丟失、穿孔和梗阻等并發癥，嚴重時可危及生命，部分患者早期可無癥狀，多發展到出現嚴重并發癥時才被發現，因此具有潛在危害性[8]。本實驗發現造模5d 后，模型組大鼠小腸黏膜均出現不同程度的肉眼及病理損傷，表明短期雙氯芬酸灌胃即可誘導大鼠急性小腸損傷，予吉法酯干預后，小腸損傷程度明顯減輕，表明吉法酯對NSAIDs相關小腸損傷具有一定的防治作用。

P38MAPK 是一類具有絲氨酸/蘇氨酸雙重磷酸化能力的蛋白激酶，生理條件下主要位于細胞漿內且表達活性很低，但可被各種刺激因素如炎癥、應激、感染、細菌脂多糖、各種細胞因子等磷酸化激活，轉位進入細胞核內，通過激活多種轉錄因子，使效應細胞分泌多種炎癥因子和黏附分子，從而參與多種炎癥性疾病的發病過程[9-11]。近年來有研究發現，P38MAPK 信號通路可能在多種原因引起的腸道損傷中起重要作用。Wan 等[12]發現用?；悄懰徕c誘導的重癥急性胰腺炎大鼠出現明顯的全身炎癥、腸道屏障損傷和腸道微生物群紊亂，在急性胰腺炎模型組大鼠腸組織中，p-P38MAPK 表達水平顯著升高，給予特異性抑制劑 SB203580 抑制P38MAPK 的表達后，腸道炎癥反應明顯減輕，表明P38MAPK 在急性胰腺炎大鼠腸屏障損傷的發生中起重要作用。Yin 等[13]采用腫瘤壞死因子-α 處理的小腸隱窩上皮細胞建立腸上皮細胞損傷體外模型，實驗發現在受損的小腸陷窩上皮細胞中磷酸化（p）-P38MAPK 蛋白的表達顯著增加，表明該信號通路被激活，使用P38MAPK抑制劑S203580后，p-P38MAPK及相關下游分子的表達水平顯著降低，對受損腸上皮細胞具有顯著的修復作用。本實驗結果顯示，p-P38MAPK 在對照組小腸組織中僅有微弱表達，而在雙氯芬酸模型組中，p-P38MPAK 的水平顯著增加，表明在服用NSAIDs 后大鼠小腸組織中p-P38MAPK被大量活化，而經吉法酯干預后p-P38MAPK 的表達明顯減弱，證實 P38MAPK 信號通路的激活在NSAIDs 相關小腸損傷中起重要作用，而吉法酯可抑制P38MAPK 的活化。

急性炎癥過程中，白細胞的黏附及向炎癥部位的浸潤是非常重要的病理變化過程，也是局部組織微循環損傷的關鍵。ICAM-1 通過控制中性粒細胞趨化性、黏附性和從血液向組織遷移，從而導致全身炎癥和器官損傷[14]。在腸組織中，ICAM-1 廣泛表達于中性粒細胞、腸內皮細胞和上皮細胞表面，炎癥發生時可被P38MAPK、NF-κB 等多種信號通路及脂多糖等刺激因子激活，造成腸黏膜損傷[15-17]。Fusco 等[18]研究發現，在急性胰腺炎相關腸道損傷中可檢測到ICAM-1的過度表達，腸道炎癥改善后，ICAM-1 的表達顯著降低。Zhao 等[19]在急性放射性直腸炎小鼠直腸黏膜中檢測到ICAM-1 表達增加，給予懷化散、白頭翁方等中藥治療后，直腸黏膜損傷修復，ICAM-1 表達下調。Jin 等[20]用一種有效的抗炎劑咖啡酸苯酯通過調節大鼠氧化應激、細胞凋亡和P38MAPK 的激活，下調ICAM-1 的表達，從而減輕電離輻射誘導的腸損傷。由此可見，ICAM-1 的表達增高與腸道損傷密切相關。本實驗中ICAM-1 在模型組大鼠小腸組織中的表達顯著高于對照組（P<0.01），而經吉法酯干預后ICAM-1 的表達顯著減弱（P<0.01）。

綜上，吉法酯可通過抑制P38MAPK 通路的激活，下調ICAM-1 等炎癥因子的表達，從而減輕腸道炎癥反應，為臨床防治NSAIDs 相關小腸損傷提供新的思路及一定的實驗依據。