循環腫瘤細胞與胃癌患者臨床病理特征及預后相關性分析*

王劉星，楊弘鑫，戴 禮，陳太春，梁百闖，王 黔,△

(1.貴州醫科大學，貴陽 550001；2.鄂州市中心醫院，湖北鄂州 436000;3.貴州醫科大學附屬醫院胃腸外科，貴陽 550001)

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，全球每年新增胃癌病例數約為100萬，死亡病例數約為80萬，其發病率在所有惡性腫瘤中排名第5位，死亡率排名第3位[1]。在我國，胃癌的發病率和死亡率分別位于所有惡性腫瘤的第2位和第3位，遠高于世界平均水平[2]。由于早期胃癌癥狀不典型，且我國高危人群胃癌篩查意識并不強烈，導致患者確診時已是進展期胃癌或有遠處轉移，標準的D2手術治療效果較差。復發和轉移是導致胃癌術后低生存率的主要原因[3]。

循環腫瘤細胞(CTC)是原發灶和轉移瘤之間銜接的重要“橋梁”，在腫瘤轉移過程中發揮著重要作用。CTC從原發性或轉移性腫瘤脫落，通過血液循環進行遷移。在遷移過程中，大多數CTC經過失巢凋亡、受到血流剪切應力的機械損傷及機體免疫細胞的消除，最終僅有<0.01%具有高轉移潛能的CTC可以存活，發生遠處轉移，在遠處器官中形成新腫瘤[4-7]。腫瘤的進展與上皮-間質轉換(EMT)有關。EMT在CTC存在的各個過程中發揮著重要作用。CTC上皮標志物表達在EMT過程中會發生下調、甚至消失，根據EMT標志物的表達可將CTC分為上皮型[表達E鈣黏著蛋白、上皮細胞黏附分子(EpCAM)、細胞角蛋白(CK)等]、間質型(表達N鈣黏著蛋白、波形蛋白、snail蛋白等)、混合型(同時表達上皮和間質標志物)。與上皮型CTC比較，間質型CTC具有更強的侵襲轉移能力，在腫瘤的轉移過程起主要作用[8-10]。CTC是一種非侵入性液體活檢方法，已在乳腺癌、結直腸癌等腫瘤中被證實與患者臨床病理特征及預后有關[11-13]。而關于CTC在胃癌的應用，特別是CTC各表型在胃癌中的應用研究極少。本研究分析外周血中CTC數目及其表型與胃癌臨床病理特征之間的相關性，探討CTC及其分型作為判斷胃癌預后標志物的可行性。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年4月1日至2020年4月1日就診于貴州醫科大學附屬醫院胃腸外科并經病理確診為胃癌的68例患者納入研究，其中男34例，女34例，平均年齡(55.0±12.3)歲。納入標準：(1)年齡18～80歲；(2)術前胃鏡及活檢證實為胃癌，行根治性胃癌切除術；(3)術前未行抗腫瘤藥物治療；(4)主要臟器功能基本正常；(5)東部腫瘤協作組(ECOG)評分為0～1分；(6)無嚴重并發癥；(7)自愿參與并簽署知情同意書。排除標準：(1)非根治性胃切除治療的胃癌患者；(2)孕婦或哺乳期婦女；(3)主要臟器功能受損；(4)各種原因所致活動性出血的患者；(5)患有嚴重的急慢性疾病；(6)有嚴重感染性疾病；(7)臨床病理資料不全或失訪。

1.2 外周血CTC檢測及CTC鑒定

CTC檢測：術前當天清晨7：00，空腹采集5 mL外周血，采用新的CTC分離富集技術分離，鑒定胃癌患者外周血中的CTC。樣本采集：準備乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝采血管、樣本保存管和樣本采集連通器；使用8號采血針和EDTA抗凝采血管采集5 mL外周血；血樣采集后，將EDTA抗凝采血管上下顛倒混勻10次；揭開樣本采集連通器上的灰色標簽；將EDTA抗凝采血管插入孔內，使孔中針頭刺穿采血管橡膠塞；揭開樣本采集連通器上的紅色標簽；將樣本保存管插入孔內，使孔中針頭刺穿樣本保存管橡膠塞，EDTA抗凝采血管內的血液將自動輸入樣本保存管內；待樣本保存管內的液面不再上升后，拔出樣本保存管，上下顛倒混勻10次；室溫放置30 min。CTC富集：離心去除上清液，固定劑固定8 min；通過真空歧管將過濾器與真空泵連接。將樣本保存管中的液體轉移至過濾器中。MRIA樣本制備：甲醛溶液室溫固定60 min。CTC鑒定和觀察：采用多重RNA探針，固定后的濾膜樣本使用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌3次。加入特異性生物標記探針EpCAM、CK8/18/19、間質型生物標記探針堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子1(Twist)與波形蛋白(Vimentin)，以及白細胞標志物CD45進行雜交，在40 ℃雜交反應3 h。未結合探針用1 000 μL洗脫液[0.1×SSC(Sigma公司,美國)]洗滌3次。加入100 μL預擴增液[30%馬血清(Sigma公司,美國),1.5%十二烷基硫酸鈉(Sigma公司,美國),3 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH 8.0)，0.5 fmol預擴增探針]，置于40 ℃孵育30 min，進行信號擴大探針反應。將膜進行冷卻，用1 000 μL洗脫液洗脫3次(0.1×SSC)，然后與100 μL擴增溶液[30%馬血清,1.5%十二烷基硫酸鈉,3 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH 8.0)，1 fmol預擴增探針]在40 ℃孵育30 min。加入3種標記熒光蛋白，分別為熒光染料Alexa Fluor 594(用于標記上皮生物標記探針EpCAM、CK8/18/19)，Alexa Fluor 488(間質型生物標記探針Vimentin和Twist)及Alexa Fluor 750(用于標記白細胞標志物CD45)，置于40 ℃孵育30 min。用0.1×SSC進行洗脫，然后使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)進行細胞核染色5 min，在油鏡(100×)下使用自動化熒光掃描顯微鏡，對樣本進行觀察。針對多種CTC特異性基因，通過不同顏色熒光信號，可進一步將CTC分型。其中Ⅰ型CTC顯示為紅色熒光信號點，Ⅲ型CTC顯示為綠色熒光信號點，而Ⅱ型CTC同時顯示紅色熒光及綠色熒光信號點，表達Ⅰ型和Ⅲ型特異性基因。

A：上皮型CTC圖，顯示紅色熒光信號；B：混合型CTC圖，顯示紅色和綠色混合熒光信號；C：間質型CTC圖，顯示綠色熒光信號。

1.3 隨訪及預后監測

定期對68例胃癌術后患者進行嚴格的隨訪。每3個月對出院的患者進行1次門診或電話隨訪。末次隨訪時間為2021年12月20日，術后隨訪時間3～44個月，中位隨訪時間28個月，截至末次隨訪日期，共有35例患者存活，33例患者死亡。總體生存期(OS)定義為手術后至患者因任何原因所致死亡。時間以月為單位統計，詳細記錄患者術后組織病理學資料、隨訪資料。隨訪內容：血常規、尿常規、肝功能、腎功能、腹部彩色多普勒超聲、計算機斷層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)，胃鏡、癌胚抗原、糖類抗原125(CA-125)及CA-199等。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 CTC檢測結果

根據既往文獻[14-15]報道及本試驗結果，將CTC≥2個視為檢測結果陽性，CTC總數<2個視為檢測結果陰性，將各亞型CTC≥1個視為檢測結果陽性，各亞型CTC<1個視為檢測結果陰性。依據該判斷標準， 68例胃癌患者治療前外周血中，CTC檢出個數為0～80個，中位數為6個，CTC陽性患者56例，CTC陰性患者12例，陽性檢出率為82.4%(56/68)。而間質型CTC檢出個數為0～11個，中位數為1個，間質型CTC陽性患者35例，CTC陰性患者33例，陽性檢出率為51.5%(35/68)。

2.2 CTC及其表型與胃癌臨床病理特征之間的關系

胃癌患者治療前外周血CTC陽性與其年齡、性別、體重指數(BMI)、ECOG評分、腫瘤部位、腫瘤分化程度、有無癌結節、神經侵犯、脈管侵犯、淋巴結轉移均無明顯相關；而與臨床分期及浸潤深度明顯相關。見表1。胃癌患者治療前外周血上皮型CTC陽性與其年齡、性別、BMI、ECOG評分、腫瘤部位、腫瘤分化程度、有無癌結節、神經侵犯、脈管侵犯、臨床分期、浸潤深度、淋巴結轉移均無明顯相關。胃癌患者治療前外周血間質型CTC陽性與其年齡、性別、BMI、ECOG評分、腫瘤部位、腫瘤分化程度、神經侵犯、脈管侵犯、淋巴結轉移均無明顯相關；與有無癌結節、臨床分期、腫瘤浸潤深度明顯相關。見表2。因混合型為上皮型和間質型復合形成，且各自所占比例不一，沒有可比性，本研究不作比較。

表1 CTC與胃癌臨床病理特征之間的相關性

表2 間質型CTC與胃癌臨床病理特征之間的相關性

2.3 CTC及其表型與胃癌術后總生存率的關系

CTC總數陰性組患者死亡率為8.3%(1/12)，而CTC總數陽性組患者死亡率為57.1%(32/56)。CTC總數陰性組術后總生存率高于CTC總數陽性組，差異有統計學意義(P=0.004)，見圖2。上皮型CTC陰性組患者死亡率為33.3%(8/24)，而上皮型CTC陽性組患者死亡率為56.8%(25/44)。上皮型CTC陰性組術后總生存率高于上皮型CTC陽性組，但差異無統計學意義(P=0.069)，見圖3。間質型CTC陰性組患者死亡率為21.2%(7/33)，平均總生存時間為38.3個月[95%置信區間(95%CI)=34.3～42.3]，間質型CTC陽性組患者死亡率為74.3%(26/35)，平均總生存時間為19.2個月(95%CI=14.9～23.5)。間質型CTC陰性組術后總生存率高于間質型CTC陽性組，差異有統計學意義(P<0.001)，見圖4。

圖2 胃癌患者CTC總數陰性組與陽性組術后

圖3 胃癌患者上皮型CTC陰性組與陽性組術后

圖4 胃癌患者間質型CTC陰性組與陽性組術后

3 討 論

CTC檢測是液體活檢最主要的組成之一，也是推動腫瘤精準診療的新技術。與普通侵入式的組織活檢及細胞學檢查相比，CTC檢測具有一系列優勢，如標本獲取容易、可反復檢測等。與循環腫瘤核酸(ctDNA)比較，CTC作為完整的腫瘤細胞，可分析的內容多、獲取的基因信息全面，是與組織活檢一致性最高的液體活檢手段[16]；CTC也可以在體外進行腫瘤細胞的分析[17]。CTC在EMT的幅度上表現出了相當程度的表型異質性，但CTC各亞型在胃癌中的應用研究極少。本研究從CTC的EMT分型著手，探索CTC及其EMT分型與胃癌臨床病理特征及預后的相關性。

既往有關于CTC與胃癌臨床病理特征相關性的研究，但這些研究得出的結論不盡相同，但總體而言，大多研究認為CTC與胃癌患者的年齡、性別、BMI、腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤分化程度無明顯相關性，而與胃癌的臨床分期、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移情況有關[18-20]。本研究利用Canpatrol Ⅲ檢測技術檢測胃癌患者外周血中CTC[21-22]，該技術采用生物納米膜過濾法+多重mRNA熒光原位雜交方法，不依賴于生物標志物，避免陽性生物富集方法漏檢已發生EMT轉化表型的CTC,避免陰性生物富集方法漏檢與白細胞相互作用的CTC。結果顯示，CTC在Ⅰ期和Ⅱ～Ⅲ期胃癌患者中的檢出率分別為63.2%和89.8%，差異有統計學意義(P<0.05)。為進一步探討原發腫瘤浸潤程度和淋巴結轉移情況與CTC檢出率有無相關性，本研究對TNM分期進一步細化，分析不同T分期和N分期與CTC檢出率的關系。原發腫瘤為T1～T2和T3～T4期患者CTC檢出率分別為66.7%和90.9%，兩組間CTC檢出率比較差異有統計學意義(P=0.030)。淋巴結轉移與否的CTC檢出率分別為72.4%和89.7%，但兩組間比較差異無統計學意義(P=0.064)。這與HUANG等[23]的meta分析結果類似，該研究者納入了包含2 566例胃癌患者的26項研究用于分析，發現CTC在Ⅰ/Ⅱ期患者中的檢出率明顯低于Ⅲ/Ⅳ期患者(OR=0.39，95%CI為0.23～0.67)。ZHENG等[24]同樣發現，CTC陽性率和胃癌TNM分期、T分期明顯相關。但楊艷麗等[25]研究發現，CTC與胃癌患者是否淋巴結轉移明顯相關(P=0.034)，這與本研究結果相差較大。考慮產生這些結果的原因主要有：(1)CTC的檢測方法不同，不同的檢測方法會導致檢驗結果的敏感度和特異度均存在一定差異；(2)選擇截斷值存在一定差異；(3)研究樣本數量存在差異。另一方面，間質型CTC比上皮型CTC具有更強的轉移侵襲能力和耐藥能力，故本研究進一步細化CTC各亞型與胃癌臨床病理特征之間的相關性，發現間質型CTC檢出同樣與胃癌的TNM分期、T分期明顯相關，而上皮型CTC的檢出與胃癌的TNM分期、T分期無明顯相關性，可能提示了間質型CTC在CTC各亞型中的重要性。

在腫瘤的轉移中，EMT在促進靜止腫瘤細胞的遷移和侵襲等部分具有關鍵作用[26]。在EMT的形成過程中，上皮細胞將失去上皮特性，出現間質特征，例如鈣黏蛋白、Vimentin、Twist和纖維連接蛋白將過度表達，從而導致其侵襲能力增強[27]。已有證據表明，間質型CTC與轉移性乳腺癌的治療結果間存在關聯[28]。HIRAIWA等[29]在44例胃癌患者的研究中發現，轉移性疾病患者的CTC數量明顯高于局限性疾病患者。但作者并未深入探討各患者CTC分型及其數目。由于CTC具有異質性，僅進行CTC總計數的預測價值有限，有必要鑒定CTC各亞型的數量。此外，間質型CTC在胃癌中的預后價值極少被研究，也未發布相關指南或共識來指導其在胃癌臨床實踐中的應用。有研究發現，單純的CTC檢出并不能較好地預測腫瘤患者的疾病轉歸，間質型CTC的檢出可能更加重要。一篇針對乳腺癌的研究發現[30]，在接受治療的乳腺癌緩解病例中，仍有部分患者CTC數量呈增多趨勢，但間質型CTC卻呈減少趨勢，另有患者治療后CTC數量呈減少趨勢，但間質型CTC卻呈增多趨勢，最終疾病出現臨床進展。這提示間質型CTC在預測乳腺癌預后中的重要作用。本研究中，上皮型CTC陰性組術后總生存率高于上皮型CTC陽性組，但差異無統計學意義(P=0.069)；CTC總數陰性組術后總生存率高于CTC總數陽性組，差異有統計學意義(P=0.004)；間質型CTC陰性組術后總生存率高于間質型CTC陽性組，差異有統計學意義(P<0.001)。死亡患者外周血間質型CTC計數高于存活患者，差異有統計學意義(P<0.001)。大多數CTC在外周血液循環中發生凋亡，從而被免疫系統清除，只有極少數CTC才能存活下來并形成轉移，而這部分存活并形成轉移的CTC絕大多數是間質型CTC或循環腫瘤微栓子(CTM)。由于CTC侵襲轉移能力是由EMT賦予[31]，因此，對CTC分型特別是間質型CTC進行檢測，能更加精準地評估胃癌患者。

本研究利用Canpatrol Ⅲ CTC檢測技術檢測胃癌患者的CTC計數及其分型，分析了CTC及其表型的檢出水平與胃癌臨床病理特征的關系，比較了間質型CTC的檢出與胃癌患者總生存期的關系。結果表明，CTC及間質型CTC可以作為胃癌輔助分期的指標，間質型CTC檢出水平與胃癌患者的預后相關。但本研究樣本量小，隨訪時間較短，還需對研究對象進行長期隨訪，有待下一步對CTC及其分型用于動態監測患者治療有效性及疾病進展情況等方面的研究。