長葉紅砂鈣依賴蛋白激酶RtCDPK16的非生物脅迫應答分析

張潔，程凱，王迎春

（省部共建草原家畜生殖調控與繁育國家重點實驗室，內蒙古自治區(qū)牧草與特色作物生物技術重點實驗室，內蒙古大學生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010040）

植物在生長發(fā)育過程中往往會遭遇干旱、水澇、高溫、冷害、高鹽等非生物脅迫，使其正常生長受到限制，甚至可能造成其死亡［1-2］。在長期適應過程中，植物逐漸形成了各種調控機制來應對不利的生存環(huán)境，鈣信號傳導系統(tǒng)就是其中之一［1，3］。當植物受到逆境刺激后，鈣離子結合蛋白能夠感知鈣信號并將其解碼，進而調節(jié)下游靶蛋白，引發(fā)一系列的胞內反應［1，4］。在高等植物中，有4類鈣離子結合蛋白，包括鈣調素（calmodulin，CaM）、鈣調素類蛋白（calmodulin-like protein，CML）、鈣依賴蛋白激酶（calmodulin-dependent protein kinases，CDPKs）及類鈣調磷酸酶B亞基蛋白（calcineurin B-like protein，CBL）［1，5-6］。其中，鈣依賴蛋白激酶（CDPKs）是植物細胞中Ca2+的主要傳感器，在各種植物發(fā)育過程和適應非生物脅迫中發(fā)揮重要作用［7-10］。

CDPK也稱CPK，是Ser/Thr蛋白激酶，具有一個可變的N端結構域和3個功能結構域，包括一個蛋白激酶結構域、一個自身抑制結構域和一個鈣調蛋白結合結構域，通常含有4個EF-Hand［11-12］。CDPK在植物根、莖、葉、果實和種子中均有高度表達［11，13］。目前在不同物種的基因組中分別鑒定出大量CDPK基因，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）中34個、水稻（Oryza sativa）31個、玉米（Zea mays）25個和毛果楊（Populus trichocarpa）20個［6，11，14］。

逆境通常會改變植物細胞內Ca2+的含量，激活CDPKs的活性，從而調控植物體內離子穩(wěn)態(tài)、抗氧化酶活性及逆境基因的表達［15］。對從不同的植物中克隆得到的CDPKs基因的功能研究表明，CDPKs在植物對非生物脅迫的響應中發(fā)揮了重要作用，過表達OsCPK12提高了水稻轉基因株系的抗氧化酶活性，減少了活性氧（reacitve oxygen species，ROS）的積累，增強了其耐鹽性［16-17］；過表達OsCPK13顯著提高了水稻轉基因株系的低溫抗性［18］；低溫會誘導玉米ZmCPK1高表達，同時抑制ZmCPK25的表達，提高其抗寒性［19］。玉米中過表達ZmCPK4能增加轉基因株系中滲透調節(jié)物質含量，提高抗旱性［20］。一些CDPKs還可以通過脫落酸（abscisic acid，ABA）信號途徑，作為非生物脅迫反應的正或負調控因子發(fā)揮作用［8，21］。脅迫條件下AtCPK3和AtCPK6正調控保衛(wèi)細胞離子通道的開放和ABA依賴的氣孔信號傳導［22-23］。擬南芥CPK10突變體在ABA和Ca2+作用下表現(xiàn)出誘導氣孔關閉的特征，推測CPK10可能通過ABA信號途徑調節(jié)氣孔運動，進而提高擬南芥對干旱脅迫的耐受性［24］。相反，CPK21的功能喪失則使擬南芥幼苗對高滲脅迫具有更高的耐受性，突變株系在標記基因表達和代謝物積累方面均表現(xiàn)出增加的脅迫反應［25］。然而迄今為止，有關CDPKs的報道依然主要集中在擬南芥、水稻、小麥（Triticum aestivum）和玉米等模式作物及農作物中，針對其他野生抗逆植物中CDPKs的功能研究報道較少。

長葉紅砂（Reaumuria trigyna），檉柳科（Tamarieaceae）琵琶柴屬（Reaumuria），起源十分古老的珍稀泌鹽小灌木，限制性分布于我國西部東阿拉善-西鄂爾多斯地區(qū)，對惡劣的生存環(huán)境具有極強的適應性［11］。為了解析該植物的抗逆機制，本實驗室前期已對其進行轉錄組測序，并對RtNHX1、RtLDOX2、RtNAC100等基因功能開展研究，發(fā)現(xiàn)這些基因通過調控離子穩(wěn)態(tài)、氧化平衡、滲透調節(jié)等途徑，在植物抵抗非生物脅迫中發(fā)揮重要作用［26-28］。然而，針對長葉紅砂的鈣傳感蛋白在其響應環(huán)境脅迫中的調控作用尚未開展研究。本研究對長葉紅砂轉錄組數據（編號：SRP008320）分析發(fā)現(xiàn)，鈣依賴蛋白激酶相關基因RtCDPK16在鹽脅迫下表達量較高，并對其進行了生物信息和表達特性分析；同時在擬南芥中超表達鑒定基因功能，為探討RtCDPK16作為鈣傳感蛋白參與植物逆境響應調控作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

長葉紅砂種子于2017年10月采集于內蒙古烏海市，充分干燥后在-20℃春化30 d。

1.2 RtCDPK16基因的克隆、表達特性分析及生物信息學分析

基于長葉紅砂轉錄組數據分析，基因Unigene430被注釋為鈣依賴蛋白激酶，與擬南芥的CDPK16基因相似度較高，其完整開放閱讀框（open reading frame，ORF）為1689 bp。設計特異性引物RtCPK16-F和RtCPK16-R，以長葉紅砂cDNA為模板，克隆完整ORF；利用在線軟件進行基因生物信息學分析；利用qRT-PCR檢測聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、NaCl、ABA、冷脅迫（cold stress，Cold）、CaCl2處理下長葉紅砂幼苗中的RtCDPK16基因的表達量，引物見表1。

1.3 RtCDPK16基因的亞細胞定位

亞細胞定位使用21 d煙草（Nicotiana tabacum）幼苗，載體為pPCAMBIA-1300和專一性的質膜Marker。共同培養(yǎng)目的載體和Marker后瞬時表達煙草，使用激光共聚焦觀察定位。

1.4 不同脅迫下過表達RtCDPK16擬南芥的抗逆性分析

1.4.1 不同脅迫下過表達RtCDPK16擬南芥的鑒定及生長指標測定 采用農桿菌花苞浸染法浸染擬南芥，T3代中挑選表達量相對較高的D1、D5和D6三個過表達（over expression，OE）株系。將OE株系和野生型（wild type，WT）種子播種于1/2 MS和125 mmol·L-1NaCl、300 mmol·L-1D-甘露醇（D-Mannitol）、3 μmol·L-1ABA培養(yǎng)基，一部分萌發(fā)10 d后用于觀察萌發(fā)率，一部分立體放置培養(yǎng)5 d后，再分別移至3種脅迫培養(yǎng)基豎直培養(yǎng)10 d觀察根長和側根數。種子萌發(fā)15 d后移至營養(yǎng)土中培養(yǎng)20 d，選取長勢一致的幼苗分別用200 mmol·L-1NaCl，100 μmol·L-1ABA水溶液脅迫處理幼苗14 d；停止?jié)菜?0 d檢測耐旱性，稱量鮮重及利用熒光法測定葉綠素含量［11］。

1.4.2 不同脅迫下過表達RtCDPK16擬南芥的生化指標測定 根據蘇州科銘試劑盒所帶說明書測定抗氧化酶SOD、POD、CAT、抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）、還原性谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）和氧化型谷胱甘肽（glutathione disulfide，GSSG）活性，H2O2、O2-及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量及滲透調節(jié)物質脯氨酸、可溶性糖和甜菜堿（betaine）含量。

1.4.3 不同脅迫下過表達RtCDPK16擬南芥葉片的DAB和NBT染色 剪不同脅迫處理下3片葉子，浸沒于1 mg·mL-1二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）和0.5 mg·mL-1氯化硝基四氮唑藍液（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）的工作液中，暗處理12 h后取出葉片用無水乙醇沖洗，并煮沸5 h脫去葉綠素，冷卻后制片，體視顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.4不同脅迫下過表達RtCDPK16擬南芥抗逆相關基因的表達量分析 提取不同脅迫處理下擬南芥RNA，反轉錄得到cDNA，基因定量分析，相關引物序列如表1。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 RT-PCR primer sequences（5′-3′）

1.5 數據處理與分析

采用IBM SPSS Statistics 22進行數據顯著性分析，GraphPad Prism 7統(tǒng)計數據并繪圖，采用Duncan’s多重比較和Studentt檢驗進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 RtCDPK16基因氨基酸序列比對和進化分析

將RtCDPK16的氨基酸序列與其他物種進行同源比對發(fā)現(xiàn)，RtCDPK16蛋白與模式植物擬南芥AtCDPK16（A.thaliana，Q7XJR9.1）的同源性為78.46%，與葡萄VvCDPK16（Vitis vinifera，KF042356.1）的同源性最高，為80.97%。利用MEGA 6.0對長葉紅砂和擬南芥、葡萄（V.vinifera）以及山麻黃（Parasponia ersonii）等含有的CDPK序列構建了系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)RtCDPK16與菠菜（Spinacia oleracea）的親緣關系較近且聚為一類，與麥瓶草（Silene vulgaris）和藜（Chenopodium alblum）的親緣關系相對較遠（圖1）。

圖1 RtCDPK16基因氨基酸序列比對和進化分析Fig.1 Amino acid sequence alignment and evolution analysis of RtCDPK16

2.2 RtCDPK16基因的表達特性分析和亞細胞定位

qRT-PCR分析顯示，該基因在長葉紅砂根、莖、葉中均有表達，其中根的表達量最高，葉次之，莖最低（圖2）。同時，PEG、NaCl、ABA、cold以及高鈣脅迫處理，均能顯著誘導該基因的表達，干旱對其誘導作用最為強烈。激光共聚焦顯微鏡觀察RtCDPK16基因定位情況表明，空載GFP在煙草細胞所有部位表達，RtCDPK16-GFP融合蛋白的綠色熒光與質膜標記蛋白（ER marker cherry）的紅色熒光則均在細胞膜穩(wěn)定表達；當兩者互相重合時，細胞膜呈現(xiàn)出黃色熒光，表明RtCDPK16在植物細胞中定位于細胞膜（圖2）。

圖2 RtCDPK16的表達特性與亞細胞定位分析Fig.2 RtCDPK16 specific expression and subcellular localization analysis

2.3 過表達RtCDPK16對擬南芥耐受非生物脅迫的影響

將pPZP221-RtCDPK16真核表達載體通過花序浸染法轉化至擬南芥（T0代）中。以T1擬南芥葉片基因組DNA為模板進行PCR擴增和電泳，發(fā)現(xiàn)轉基因株系D1～D6均在1700 bp處有明顯條帶，而野生型擬南芥（WT）無此條帶。將上述篩選得到的6個轉基因株系用含慶大霉素抗生素的培養(yǎng)基篩選至T3代，RT-PCR定量分析6個株系中RtCDPK16基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)D1/D5/D6三個株系的表達量較高且能夠穩(wěn)定遺傳，可用于后續(xù)研究（圖3）。

圖3 RtCDPK16轉基因擬南芥的鑒定Fig.3 Identification of RtCDPK16 transgenic A.thaliana

對過表達RtCDPK16擬南芥進行鹽、甘露醇、ABA脅迫處理，表型分析顯示3種脅迫下過表達株系比野生型具有更高的存活率，生長狀態(tài)明顯優(yōu)于野生型。脅迫處理后，各株系的根系發(fā)育均受到明顯抑制，但過表達株系主根長及側根數均顯著高于野生型（圖4）。

圖4 不同脅迫對轉基因擬南芥幼苗存活率和根部發(fā)育的影響Fig.4 Effects of different stress on the survival rate and root development of transgenic Arabidopsis seedlings

為進一步確定RtCDPK16在擬南芥脅迫響應中所發(fā)揮的作用，對各株系進行土培實驗，發(fā)現(xiàn)在正常條件下，擬南芥的生長狀況無明顯差異；NaCl脅迫下，野生型植株相比轉基因株系葉片生長受限，蓮座葉較小，葉片萎蔫程度較大；甘露醇脅迫下，各株系均表現(xiàn)出葉片嚴重失水、萎蔫枯黃，但過表達株系與野生型相比所受影響較小；ABA處理下，過表達株系相比野生型葉片卷曲黃化程度較小，生長表型明顯優(yōu)于野生型。NaCl、ABA、甘露醇處理下，擬南芥過表達株系的鮮重和葉綠素含量均明顯高于野生型（圖5）。

圖5 不同脅迫下擬南芥的生長表型及生理指標Fig.5 Growth phenotype，and physiological indicators of Arabidopsis under different stress

2.4 過表達RtCDPK16對轉基因擬南芥抗氧化能力的影響

為了進一步探討過表達RtCDPK16對轉基因擬南芥抗氧化能力的影響，檢測了NaCl、甘露醇和ABA脅迫處理下，擬南芥各株系的ROS積累和氧化損傷情況，結果顯示，3種脅迫下過表達株系的丙二醛（MDA）和電解質滲漏率（electrical leakage，EL）均顯著低于野生型。DAB和NBT染色結果顯示，正常條件下，野生型與過表達株系葉片無明顯的顏色差異，脅迫處理后，過表達株系相比野生型產生了較少的褐色和藍色物質，表明轉基因株系中積累的H2O2和O2-相比野生型較少；H2O2和O2-的含量檢測結果與染色分析結果一致，脅迫處理下，野生型的H2O2和O2-的積累速率和含量均顯著高于過表達株系（圖6和圖7）。

圖6 不同脅迫下的擬南芥葉片的DAB與NBT染色Fig.6 DAB and NBT staining of Arabidopsis leaves under different stress

圖7 不同脅迫下的擬南芥ROS的積累Fig.7 ROS accumulation of Arabidopsis under different stress

進一步檢測了鹽、甘露醇和ABA脅迫下，野生型和過表達株系中抗氧化酶SOD、POD、CAT的活性，AsA、GSH、GSSG及滲透調節(jié)物質脯氨酸、可溶性糖和甜菜堿的含量，結果顯示，脅迫處理顯著誘導各株系抗氧化酶活性以及抗氧化劑和滲透調節(jié)物質積累，過表達株系中SOD、POD、CAT酶活性，AsA、GSH以及脯氨酸、可溶性糖和甜菜堿的含量均顯著高于野生型，但GSSG含量顯著低于野生型（圖8）。表明過表達RtCDPK16顯著提升了脅迫處理下轉基因擬南芥的抗氧化和滲透調節(jié)能力。

圖8 不同脅迫下擬南芥的抗氧化酶活性和滲透調節(jié)物質含量Fig.8 Antioxidant enzyme activity and content of osmotic regulators of Arabidopsis under different stress

2.5 過表達RtCDPK16對擬南芥中脅迫相關基因表達量的影響

利用qRT-PCR檢測鹽、甘露醇和ABA脅迫下擬南芥中脅迫相關基因的表達量，結果表明，脅迫處理下抗氧 化 酶 相 關 基 因（AtSOD1、AtPOD1、AtCAT1、AtAPX1）、脅 迫 響 應 相 關 基 因（AtRD29A、AtDREB2A、AtRD22）、脯氨酸合成基因AtP5CS1以及ABA合成和信號通路關鍵元件基因（AtNCED3、AtABF4和AtSNRK2.2/2.3）均在過表達株系中被顯著誘導表達，表達量明顯高于野生型，表明過表達RtCDPK16促進了脅迫響應相關基因和ROS清除相關酶基因在轉錄水平的提高（圖9）。

圖9 不同脅迫下相關基因的表達量Fig.9 Expression of related genes under different stress

3 討論

3.1 過表達CDPKs對植物非生物脅迫的耐受性的影響

許多研究表明，CDPKs參與了植物對多種非生物脅迫的耐受調控。干旱、高鹽和低溫顯著誘導擬南芥中AtCDPK1和AtCDPK2的表達，同時過表達AtCDPK1能顯著提高轉基因株系的葉綠素含量和鮮重，緩解鹽脅迫帶來的生長抑制［29］。研究發(fā)現(xiàn)過表達唐古特白刺（Nitraria tangutorum）NtCDPK1可以顯著降低轉基因擬南芥的根長和側根數減少率，降低脅迫下葉片的黃化萎蔫程度，促進生物量和葉綠素的積累，從而提高其耐鹽耐旱及耐冷性［1］。在擬南芥中異源表達胡楊（Populus euphratica）PeCPK10基因可以顯著提高轉基因擬南芥的耐寒能力［30］；過表達葡萄的VaCPK20可以提高轉基因擬南芥在干旱和鹽脅迫下的存活率［31］。本研究從泌鹽鹽生植物長葉紅砂中克隆了RtCDPK16基因并將其在擬南芥中過表達，驗證其基因功能，結果證實，RtCDPK16提高了轉基因擬南芥幼苗在鹽、干旱及ABA脅迫下的存活率、根長和側根數、鮮重和葉綠素含量，表明過表達RtCDPK16可有效緩解轉基因株系因脅迫引起的生長抑制，增加其對脅迫的耐受性。

3.2 CDPKs對植物活性氧的積累和清除能力的影響

非生物脅迫誘導活性氧（ROS）的積累，而ROS作為一種有毒分子引起細胞的氧化損傷［32］。植物在抵抗非生物脅迫中已經進化出了防御系統(tǒng)，以盡量減少和防止ROS對細胞的氧化損傷，維持細胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)［33-34］。馬鈴薯（Solanum tuberosum）的CDPK4和CDPK5能通過磷酸化NADPH氧化酶來調節(jié)ROS的產生［35］，水稻OsCPK12的過表達降低了鹽脅迫條件下轉基因株系中H2O2含量，提高了水稻的耐鹽能力［36］。水稻OsCDPK4的超表達顯著降低了轉基因植物膜脂過氧化程度，提高細胞膜的完整性，從而提高水稻的耐鹽耐旱能力［37］，玉米ZmCPK4在擬南芥的過表達同樣能增加滲透調節(jié)物質的含量，保證細胞膜的完整性，進而提高轉基因擬南芥的抗旱性［20］。此外，CDPKs除抑制活性氧的產生，還可以通過提高抗氧化酶的活性，積極清除體內活性氧來應對脅迫。水稻中過表達OsCPK4/12/13均可以顯著提高轉基因植株的SOD/POD/CAT/抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）等相關抗氧化酶活性，增加脯氨酸和可溶性糖的含量，從而降低MDA含量，積累更少的ROS，提高水稻的低溫抗性［36-38］。也有研究發(fā)現(xiàn)，CDPKs有時也作為負調控因子起作用［39］。例如突變擬南芥的CPK21，能顯著提高其抗氧化酶活性及脯氨酸含量，降低電導率，表現(xiàn)出比野生型更強的耐旱性［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中過表達長葉紅砂RtCDPK16顯著降低了擬南芥的膜損傷程度，緩解了電解質滲漏，使轉基因植物積累較少的H2O2和O2-，顯著提高了脅迫條件下轉基因擬南芥的抗氧化酶SOD、POD、CAT活性，增加了抗氧化劑AsA、GSH和滲透調節(jié)物質脯氨酸、可溶性糖和甜菜堿的含量，從而提高了轉基因株系的抗氧化和滲透調節(jié)能力，降低了細胞膜的氧化損傷程度和電解質滲透率。同時發(fā)現(xiàn)轉基因株系的抗氧化酶基因AtSOD1、AtPOD1、AtAPX1、AtCAT1，脯氨酸合成關鍵基因AtP5CS1在脅迫條件下被顯著誘導表達，過表達RtCDPK16在轉錄水平上調控了抗氧化酶基因和滲透調節(jié)物質基因的高表達，從而促進了酶活性的升高和脯氨酸/可溶性糖含量的增加，使轉基因植物比野生型具有更高的氧化和滲透平衡調節(jié)能力。

3.3 CDPKs參與調控ABA信號的分子機制對抗逆性的影響

CDPKs通過參與ABA信號轉導，介導植物對非生物脅迫的耐受性［40］。有報道稱擬南芥CDPKs通過磷酸化ABA響應元件結合因子（ABFs）參與ABA信號通路，如擬南芥CPK4和CPK11參與了ABA調控的生理過程，包括種子萌發(fā)、幼苗生長、氣孔運動和對鹽脅迫的耐受性。CPK4和CPK11可以磷酸化兩個ABA響應轉錄因子ABF1和ABF4，表明它們在CDPK介導的ABA信號通路中是正調控因子［41］。擬南芥CPK32與ABF4相互作用，并在體外可以磷酸化ABF4，表明CPK32可以通過磷酸化ABF4調控ABA應答基因的表達，進而參與ABA信號通路對脅迫的應答［42］。此外，擬南芥的CPK10突變體在ABA和Ca2+作用下表現(xiàn)出氣孔關閉誘導和氣孔開放抑制受損［24］。本研究發(fā)現(xiàn)脅迫條件下轉基因擬南芥中ABA合成及信號通路相關基因AtABF4、AtSNRK2.2/2.3和AtNCED3的表達量均顯著高于野生型，推測RtCDPK16的超表達可能促進植物ABA信號的轉導，通過ABA信號通路調節(jié)下游相關脅迫應答反應。

4 結論

1）RtCDPK16的過表達有利于轉基因擬南芥氧化平衡的維持，減輕脅迫引起的氧化損傷，提高了抗氧化酶活性，緩解了脅迫帶來的ROS積累，增加了滲透調節(jié)物質的積累，促進了轉基因植物的抗逆性。

2）RtCDPK16作為一個正調控因子在植物抗逆過程中發(fā)揮作用。

3）RtCDPK16可能促進ABA參與植物對脅迫的應答，通過ABA信號通路調節(jié)應對相關非生物脅迫。