氫氧包衣茶提取物（EGCG）對兔耳痤瘡模型的影響

李 睿，方躍華，林雨虹

（1.福州市第一醫院皮膚科；2.福州市第一醫院檢驗科，福建 福州 350000）

痤瘡是一種累及面部毛囊皮脂腺的慢性炎癥性疾病。痤瘡好發于青春期，中國人群截面統計痤瘡發病率為8.1%[1]，是常見的皮膚疾病。痤瘡的發病機制與雄激素刺激皮脂腺分泌旺盛、痤瘡丙酸桿菌等微生物感染，免疫介導炎癥反應等密切相關[2]。痤瘡的治療有外用藥物治療、系統藥物治療、物理和化學治療、中醫和中藥治療等，其中外用藥物是基礎治療。目前痤瘡的外用藥物治療主要有維A酸類乳膏，外用抗菌藥物類以及水楊酸等其他外用藥物。外用維A酸類藥物以及抗菌藥物中的過氧化苯甲酰有不同程度的皮膚刺激，可以造成皮膚屏障功能受損。抗菌藥物中的抗生素外用容易引起痤瘡丙酸桿菌耐藥[1]。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是從綠茶中提取的一種多酚類成分，是綠茶兒茶素中含量最高的組分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗突變、抗輻射和紫外線等作用[3]。有學者研究發現EGCG還具有抑制細菌繁殖、抑制皮脂腺細胞生長和分泌、抗炎等作用[4-7]，這些作用與痤瘡發病機制相關，因此EGCG對于治療痤瘡，可能有效果。但是，因為皮膚屏障的保護和吸收作用，外用藥物發揮作用必須要有合適的劑型使之有一定程度的透皮滲透。透皮吸收因子TAF是一種新型的透皮技術，該技術通過臭氧促透，剪切、包衣等步驟，使活性成分能透過皮膚屏障。

因現有痤瘡外用藥物的局限性，研究開發有效、安全副作用小的新型外用藥物存在臨床需求。本研究利用新型的TAF透皮生物技術對EGCG進行處理，形成新劑型EGCG，即氫氧包衣EGCG，我們通過研究其對痤瘡形成機制相關方面的影響，探索痤瘡外用藥物治療的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

12周齡雄性新西蘭大白兔，體重2.5-3kg（贛州市畜牧水產研究所），98%EGCG（西安東峰生物科技有限公司），痤瘡丙酸桿菌（BNCC336649，北納生物），0.025%維A酸乳膏（重慶華邦制藥有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 利用TAF技術（江蘇朗沁科技有限公司）對98%EGCG進行氫氧包衣，形成包衣EGCG。

1.2.2 活化痤瘡丙酸桿菌。稱取BHI腦心浸液肉湯取19.25g，加蒸餾水定容至500mL，121℃高壓滅菌20min，取出冷卻至室溫備用；0.1‰維生素和0.1‰氯化血紅素通過0.22μm濾膜過濾除菌后，加入到冷卻的BHI腦心浸液肉湯中，再存放至4℃冰箱備用。取50mL BHI培養基，按1% (v/v)接種比例來滴加500μL痤瘡丙酸桿菌濃縮菌液進行厭氧培養。

1.2.3 建立兔耳痤瘡模型。選取24只12周齡雄性新西蘭大白兔，飼養于溫度18℃-26℃，濕度40%-70%條件下。在經過1周的適應性飼養后，對兔子左耳內耳構建兔耳痤瘡模型。在兔子左耳內耳中央附近涂抹2%粗煤焦油，0.5ml，范圍為2×2-4×4CM2。連續兩周，從給煤焦油第7天起，隔天皮內多點（6點）注射0.2ml痤瘡丙酸桿菌溶液（3×108/ml）于兔耳涂煤焦油處，共4次進行動物模型構建。

1.2.4 為了探究包衣EGCG治療兔耳痤瘡的關系，將動物分為Control、Model、維A酸乳膏組（建模第一天起同時涂抹維A酸乳膏5mg/kg/d，共14天）、包衣EGCG（建模第一天起同時涂抹包衣EGCG，20mg/只/天，共14天）。

1.2.5 HE染色。切取各組實驗區域皮膚組織，制作石蠟切片，石蠟切片經烤片、脫蠟、水化后，用蘇木素染液染色3min-5min，流水沖洗后，用1%鹽酸酒精分化，反藍液反藍，伊紅染色3min-5min后，切片脫水，封片，在顯微鏡（BX43，Olympus）下觀察組織病理變化情況。

1.2.6 RT-qPCR檢測。采用Trizon試劑提取皮膚組織中的總RNA，采用RNA超純提取試劑盒提取mRNA，利用紫外可見分光光度計測定mRNA的濃度和純度（OD260/OD280），通過RNA逆轉錄試劑盒合成cDNA，采用熒光PCR儀進行熒光定量PCR。反應步驟如下：預變性95℃，10min；變性95℃，10s；退火58℃，30s；延伸72℃，30s；40個循環。以GAPDH作為內參，基因的相對表達量根據2-△△Ct法計算。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.3 統計學處理

采用SPSS 18統計學軟件進行數據分析。計量資料用（)表示，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用卡方檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色

如圖1結果顯示，Control組兔耳柔軟、薄白、毛細血管清晰，兔耳管開口處可見毛孔大小均勻，皮膚組織完整。Model組皮膚表皮明顯角化增厚、棘層細胞層數增多、毛囊擴張、毛囊面積增大。維A酸乳膏治療組和包衣EGCG組治療后表皮均出現角化厚度減小、棘層細胞層數均減少，毛囊擴張程度減輕，毛囊面積減小。

圖1 （HE染色，200×）

2.2 RT-qPCR檢測

如圖2結果顯示，與Control組相比，Model組IL-1a、IL-8、IL-6促炎因子顯著上升，差異有統計學意義（P＜0.05）。與Model組相比，維A酸乳膏組、包衣EGCG組治療后IL-1a、IL-8、IL-6炎癥因子均顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 qPCR檢測IL-1a、IL-6、IL-8、NF-κB基因表達水平

3 討論

綠茶是一種具有中國特色的食品，也受到世界上其他國家和地區的人們的喜愛。不僅飲用綠茶的養生功能被不斷地發現與開發，綠茶提取物還是世界范圍內極受歡迎的護膚品的添加成分。茶多酚是從茶葉中提取的一類多酚類的物質，其中兒茶素的占比最高，兒茶素主要包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）表沒食子兒茶素（EGC）表兒茶素沒食子酸酯（ECG）表兒茶素（EC）[8]。其中EGCG含量最高，具有較強、較多的生物活性。針對痤瘡的發病機制，EGCG在抑制皮脂分泌方面，可以通過活化MAPK通路，激活Nrf2通路及下游基因，達到抑菌、抗炎及抑制皮脂分泌的作用，并且可以減少自噬抑制因子mTORC的表達，促進細胞自噬，從而抑制皮脂分泌[9]。EGCG的抗炎機制，一方面與其的抗氧化作用相關，EGCG可以通過清除自由基和氧化劑，抑制氧化應激性，減輕氧化劑介導的損傷；通過抗氧化及阻礙細胞內鈣離子的流動抑制MCP-1的高表達，抑制轉錄因子STAT1的激活。除此之外，EGCG還可以干預NF-κB信號通路、抑制轉錄因子NF-κB從而發揮抗炎作用[10-11]。

雖然EGCG在體外有諸多的活性和作用，但是臨床使用卻受限，主要原因是EGCG的化學結構極不穩定，容易受到各種環境及理化因素的影響，因此，EGCG在體內分解快，生物利用度較低。在外用于皮膚的治療應用中，又因為EGCG具有較高的水溶性，導致它在皮膚的滲透性差[12]。因此，如何提高EGCG的穩定性和生物利用度是近來研究的熱點。在外用藥品或化妝品中，為了使活性成分更好地發揮作用，通常會使用促透劑，促進有效成分的透皮。經過對促滲劑的深入研究，大多數促滲劑都表現出不同程度的局部或全身毒性。隨著透皮技術的進展，出現了新的劑型如脂質體、微乳、納米粒等[13]。TAF技術也是一種新型的透皮吸收技術，該技術可以可逆的改變皮膚屏障脂質的排列構型，擴大細胞間隙，使細胞間的透過能力增大，并能改變分配系數，增加細胞旁路轉運，使被包衣成分深入皮膚表皮層，真皮層至皮下組織，克服了水溶性成分透皮吸收差的缺點。而本次研究的結果也呈現了經過TAF技術進行氫氧包衣后的EGCG對于兔耳痤瘡模型的治療效果與0.025%維A酸乳膏相當，為EGCG治療痤瘡提供了新的思路。對于氫氧包衣的EGCG是否能用于臨床上痤瘡的治療，還需要更多方面，更加深入，更大樣本的研究。